免疫组库测序ppt课件

1、。SEQ国际机场。目录，免疫文库，免疫文库测序技术的信息分析。1。免疫库的概念，免疫库是指在任何给定时间，个体循环系统中所有功能多样的B细胞和T细胞的总和。为了研究免疫群体文库，有必要确定免疫系统中BCR和三氯异氰尿酸的基因或核糖核酸序列。影响免疫库组成的因素很多。如年龄、疾病、免疫记忆、免疫缺陷遗传病、疫苗、器官移植、癌症治疗等。根据淋巴细胞DNA来源的不同，免疫库的研究可分为以下几类：(1)健康人一般采用提取外周血的方法；对于特殊人群，如白血病患者或白血病细胞微小残留病患者，骨髓血也可作为淋巴细胞DNA的来源，以深入研究其免疫库的变化。新生儿脐带血可用于研究出生早期免疫池中人与母亲的关系和

2、差异；对于动物，尤其是小动物，脾脏也是普通淋巴细胞的DNA来源器官。唾液和尿液被用作淋巴细胞的DNA来源。BCR，B细胞受体(BCR)，也称为免疫球蛋白(免疫球蛋白)，是一种由B细胞分泌的蛋白质分子，可以与抗原结合。成熟的b细胞可以在细胞外分泌IG来中和抗原。免疫球蛋白由两条重链(H)和两条轻链(L)组成，它们通过二硫键连接。重链(IGH)由变量(V)、多样性(D)、连接(J)和常数(C)基因片段组成。轻链(IGL)只是从V-J-C重组而来.重链(H链)分为V区、C区、跨膜区和细胞质区。而轻链(l链)只有v和c区。v区由VH和VL结构域组成，每个结构域有三个CDR，即CDR1、CDR2和CDR

3、3。最具多样性的重链CDR3区是决定B淋巴细胞抗原识别的关键位点，其多样性来源于免疫球蛋白重链末端的基因重排(51个功能基因片段)-IGHD(23个功能基因片段)-免疫球蛋白重链前端(6个功能基因片段)、在免疫球蛋白重链和免疫球蛋白重链连接过程中模板无关的核苷酸插入或剪切以及体细胞高频突变。细胞受体和T细胞受体是T细胞分泌的膜蛋白分子。与BCR不同，TCR只存在于细胞表面，但不分泌。t细胞的TCR可以由链和链组成，也可以由链和链组成。链和链由V-J-碳基因片段重组而成，链和链由维-德-焦-碳基因片段重组而成，类似于BCR的重链和轻链。参与特异性免疫反应的T淋巴细胞主要是/T淋巴细胞，占外周血淋

4、巴细胞的90-95%。TCR链CDR3在抗原特异性识别中起关键作用，它是与抗原肽直接结合的位点。其编码基因位于人类7号染色体(7q34)上，全长620kb，由50多个可变区(v区)基因片段、两组上游d基因片段/下游恒定区(c区)基因片段和67 j区基因片段组成。这些基因在T淋巴细胞的早期发育中不连续分布，并在胸腺中分布。在成熟的T淋巴细胞阶段，V、D、J和C基因片段连接成VDJC片段。推测通过胚胎系的VDJC基因片段的随机组合和重排以及TCR/链和/或链V区基因的重排产生的TCR克隆的数量高达1015-1018，构成了极其丰富的T淋巴细胞抗原受体文库。从不同的t淋巴细胞克隆不同序列或长度的TC

5、R-CDR3基因，翻译不同的CDR3多肽序列，从而反映t淋巴细胞的功能状态。当发生特异性免疫反应时，TCR多样性发生变化，出现寡克隆甚至单克隆扩增。随着胸腺的再生，大量原始T淋巴细胞增殖，TCR免疫池多样性得到恢复和重建。不同VDJ基因片段组合的多样性；不同基因片段的随机插入和缺失导致连接的多样性，而核苷酸在V(D)J连接区的插入和缺失反映在互补决定区簇CDR3序列的多样性上；不同重链和轻链组合的多样化；和b细胞受体特有的随机高频突变。4、BCR/TCR多样性的机制，5、研究免疫活性文库的过程，提取样品DNA/RNA:根据待研究的问题设计实验方案，提取血液或组织样品，分离b细胞或t细胞，然后提

6、取和纯化DNA/RNA。构建的测序文库：根据不同的实验条件添加不同的扩增引物进行聚合酶链反应扩增，从而扩增待测序的免疫基因，最终构建测序文库。测序：由第二代高通量测序仪进行，如罗氏454、Illumina Hi Seq2500、Illumina Misseq等。信息分析：对测量的序列数据进行信息挖掘，以发现生物学意义和结果。数据分析主要包括数据清洗、质量控制、不同样品的数据分离、序列比对、序列注释和下游分析。免疫文库测序(IR-seq)针对T/B淋巴细胞，采用多重聚合酶链反应(5RACE)技术扩增互补决定区(CDR3区)，决定了B细胞受体(BCR)或T细胞受体(TCR)的多样性。通过在扩增早期

7、使用对基因靶标特异的引物，在指数扩增期使用普通引物，大大提高了所有模板的扩增效率，从而具有更高的特异性和敏感性。与模板相比，虽然DNA易于制备，但在聚合酶链反应扩增过程中容易产生非生产性重组序列，并且在J-C区之间存在大量内含子，因此下游引物只能位于J区，聚合酶链反应扩增的灵敏度一般由细胞的拷贝数决定；相对而言，核糖核酸应取自新鲜样品，其产物大多为高产CDR3序列，下游引物可从高度敏感的C区选择。4，主流测序技术及其优缺点，免疫文库分析的准确性取决于HTS数据的可靠性。高温超导数据的可靠性取决于测序的准确性和覆盖的深度。热测序平台，离子种子：创新的半导体芯片测序技术平台原理是在DNA聚合物中加

8、入脱氧核糖核酸将释放氢离子。我们用半导体来测量这些氢离子引起的酸碱度变化。通过同时测量数百万个这样的变化，我们可以确定每个片段的序列。高效的目标覆盖率使用多重聚合酶链反应设计，达到97%-200个碱基的平均目标覆盖率读数长度或400个碱基的读数长度。5。信息分析，1。基础数据统计数据过滤、处理原始数据的数据结构以消除联合污染序列和低质量读数、数据拼接、消除测序背景和有效数据结构数据统计、数据输出统计以及测序数据的组成和质量评估2。数据比较分析，比较分析，再比较与维地/J基因片段比较的数据库(IMGT)，寻找最佳维地/J比较结果3。序列结构分析，CDR序列组成和序列碱基组成分析，CDR序列的碱基

9、插入和缺失，编码CDR序列翻译成氨基酸和肽链，4。免疫文库的构建免疫文库表达谱的构建，多种抗体文库克隆表达的统计，免疫文库多样性的展示，绘制2D和V/J基因表达的3D图片。5.样本间多样性差异分析(辛普森系数，香农韦纳系数)样本间克隆表达差异分析(CDR3，维-德-杰)分组样本间克隆表达差异分析(CDR3，维-德-杰)6。红外SEQ问题：1。构建免疫文库的过程实际上是基于多引物聚合酶链反应来覆盖BCR或TCR序列的多样性，这将涉及由多引物之间的扩增效率引起的偏好问题。一套好的多引物将总是平衡每对引物之间的扩增效率，并试图避免引物之间的非特异性扩增和二聚化。可以说，构建的免疫文库的质量直接取决于其多引物的质量。以BCR人体为例，据保守估计，BCR的物种多样性约为1011种，其中骨髓占17%，全身淋巴结占28%，脾脏和黏膜系统占23%，外周血仅占2%，其余约占30%。然而，我们对人类免疫库的研究往往是基于方便来源的外周血。显然，外周血对免疫库多样性的贡献率远远不够。为了尽可能全面地反映人类免疫库的全貌，我们可以通过增加样本量来弥补单一的人类外周血免疫库不能反