HIV感染的实验室检测ppt课件

1、、1、HIV抗体检测原理和方法、石嘴山市疾病预防控制中心艾滋病初筛中心实验室、2、HIV感染实验室检测常用HIV病原学检测方法：细小病毒分离抗原检测核检(cDNA检测-PCR、RNA检测-细小病毒搭载量)其他方法：反转录酶检测， 常用原位杂交HIV抗体检测方法： ELISA快速HIV检测免疫标识牌法(Western Blot )等方法：免疫荧光法(IFA )、放射免疫沉淀实验，3、抗原检测的目的为： (1)检测早期感染，缩短窗口时间(可提前12周) HIV-P24抗原阳性不能仅作为HIV感染窗口期的辅助诊断依据，4 )新生儿感染、乳婴儿子的HIV抗体阳性不能用于诊断来自感染HIV乳婴儿子母亲的

2、HIV抗体的持续存在期间。 到1.8月龄，可以采用HIV P24抗原检测、细小病毒分离培养、RNA和DNA测定等多种非抗体依赖性检测方法诊断新生儿HIV感染。 1.8月龄在先的乳婴儿子感染HIV诊断应结合临床表现和实验室综合诊断。5、抗体检查的目的、输血与移植的安全(为了接受者的安全)监测(为了了解人的流行情况)临床HIV疾病的诊断(为了了解个人感染情况)为了达到上述某一目的的HIV检查可能不适合其他目的，如输血服务的检查在临床诊断HIV感染HIV抗体检测、HIV抗体检测可分为筛选试验(包括初筛和复验)和确认试验(WB )。 (一)检验试剂筛选的试剂必须通过国家食品药品监督管理局注册批准、批次

3、检验，临床评价质量优良，有效期内的试剂。 目前常用的筛选试剂有酶催化剂免疫、颗粒凝集等快速诊断试剂。 采用供血机制进行血液筛选应采用HIV-1/2混合型酶催化剂免疫试剂。 必须从自体供血的单位进行HIV抗体检查。7、(二)筛分法、1 .常用筛分法为酶催化剂免疫试验(ELISA )目前国内外主要使用第三代(双抗原穿山鼠开关法)试剂，少数使用第二代试剂。 血源筛选仍以第三代ELISA为主，国际上一些国家和地区已将线性免疫酶催化剂测定(第四代ELISA试剂)用于血源筛选。 第四代ELISA试剂是新近发展的HIV抗原抗体联合检测试剂，在云同步能检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体。 与第三代抗HIV-

4、1/2试剂相比，检测时间提前了4-9.1d。 其优点是云同步检测抗原抗体，降低血源筛选的残留危险度。 8、酶催化剂免疫吸附试验Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化和抗体或抗原的酶催化剂标识牌。 结合在固相载体表面的抗原或抗体保持免疫学活性，酶催化剂标识牌的抗原或抗体保持免疫学活性，也保持酶催化剂的活性。 测定时，被检体(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体反应。 9、ELISA的原理是，将固相载体上形成的抗原抗体复合物从液体中的其他物质中进行洗涤的方法分离。 即使加入酶催化剂标识牌的抗原和抗体，也可

5、以通过反应与固相载体结合。 此时，固相上的酶催化剂量与标本中的被检物质量显示出一定的比例。1.0、ELISA的原理是，加上酶促反应的基质，基质被酶催化剂催化于有色物，生成物的量与标本中的被测物质的量直接相关，因此可以根据显色浓淡进行定性或定量分析。 由于酶催化剂催化效率高，间接放大了免疫应答结果，使测定方法灵敏度高。 检测1.1、ELISA类型、双抗原穿山鼠开关法、抗体双抗体穿山鼠开关法、抗原间接法、抗体竞争法、捕获涂层法等1.2、双抗原穿山鼠开关法抗体，并将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。 放入检体进行保温。 标本中的抗体与固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物。 清洗除去其他未结合物质

6、。 加入酶催化剂标识牌抗原，保温反应。固相免疫复合物上的抗体与酶催化剂标准抗原结合，彻底清洗未结合的酶催化剂标准抗原。 加入底物显色。 固相上的酶催化基质变成有色物。 根据比色检测标本中的抗体量。 1.3、抗原的检验板、患者的抗体、酶催化剂、显色剂、ve、ve、酶催化剂结合免疫吸附试验、HIV检验的介绍、ELISA、1.4、质量控制、阳性、 结果表明，Introduction to HIV Testing、Module 1 Sub Module 3 PPT02、1.5、2、快速检查(RT )及其他检查，随着艾滋病病毒感染者和AIDS患者抗反转录病毒治疗的进展，以及为无症状艾滋病病毒感染者提供自

7、主咨询检查(VCT )的迫切需要(1)动物胶粒子凝聚试验(PA):PA是HIV血清抗体检测的简便方法之一，是以HIV抗原敏化作用动物胶粒子为载体，与样品发生作用，混合保温的方法。 检体中含有HIV抗体时，用抗原敏化作用的动物胶粒子与抗体发生抗原抗体反应，从动物胶粒子在细孔内的凝聚状况判断结果。 PA试剂有2种，HIV-1和HIV-2抗原共同敏化作用的PA试剂(AFD HIV-1/2 PA )是中国食品压电石英药品监督管理局(SFDA )登记的HIV-1、HIV-2抗原分别敏化作用的PA试剂(SERODIA-HIV-1/2 ) (2)斑点EIA或斑点ELISA(dot-EIA ) :以硝酸纤维膜

8、为载体，在膜上点状滴加HIV抗原，这是固相抗原。(3) 1.6，PA的原理图，1.7，(PA )检查结果的判定，1.8，(4)斑点EIA或斑点ELISA(dot-EIA ) :以硝酸纤维膜为载体，在膜上点状滴加HIV抗原。 加上血清样品的作用，以后的步骤与ELISA相同。 阳性结果显示膜上抗原部有有色斑点。 反应时间在10 min以内，使用抗原量少。1.9、(3)斑点免疫胶体金(或胶体硒)快速试验，金标纸采用双抗原穿山鼠开关法免疫测定原理，选择纯化基因工程制备的gp36、gp41、p24抗原作为包衣抗原、gp41、gp36基因工程抗原和p24合成多肽。 被检体中含有HIV抗体时，首先与金标识牌

9、抗原结合，反应复合体在色谱分析法作用下沿着硝酸纤维膜向前方移动，遇到被复抗原时，形成Ag-Ab-Ag-Au复合体，浓缩到被复线上，形成红色沉淀线。 因为在云同步被膜上有品质管理线，红线有2条的情况下判定为阳性，红线只有1条的情况下判定为阴性。2.0、金标法试剂、试剂稳定，可在室温下长期保存。 试验时无需任何设备，快速、简便、专一性好，易感性相当于中度敏感的ELISA，适用于紧急检查、门诊急救个体检查。 现在国内有注册为SFDA的海外进口试剂和国内产品。 通常，可以在1030min以内判断结果。 (4)艾滋病唾液检测卡：硝酸纤维膜上人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，唾液中包含的HIVg

10、p41/gp36蛋白抗原，唾液中包含的HIVgp41/gp36蛋白抗原，唾液中包含的HIVgp41/gp36蛋白抗原，唾液中包含的HIVgp41/gp36蛋白抗原，唾液中包含的HIVgp41/gp36蛋白抗原，唾液中包含的HIVgp41/gp36蛋白抗原，唾液中包含的HIVgp41/gp36蛋白主要检测唾液中的HIV IgA和IgG抗体，易感性专一性接近ELISA，可以避免静脉穿刺。 但是，样品的预处理时间长，销售价格高。 以唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、免疫印迹法(WB )试剂得到了美国FDA的认可。 (5)其他快速筛选试验方法：家庭HIV检查(Home Access System

11、)等。、2.9、快速HIV检验和常规HIV检验、快速*平均4.5分(1.0分2.5小时)常规平均3.5小时(9.4分1.6时间) *一般不需要特别设备，试剂可不存放在冰箱，3.0，快速试剂的极限，一般不用于血液筛选(5年行动计划除外)假阳性反应， 例如作为临床诊断，复查和确认需要一定的假阴性反应(特别是暴露时间3个月)的跟踪检查(说明检查前后的商谈的必要性)，3.1，(3)筛选检查工序，根据检查目的选择符合要求的筛选试剂，对样品进行初筛和复查(复查) (1)实验准备：试验开始前将试剂和样品置于室温(1823 )，按照实验室SOP准备试剂。 磷酸盐缓冲液：液体内有结晶时，放置至溶解于3.7，用蒸

12、馏水1:25稀释浓缩液，保存4周。 TMB基质液：使用前配制，TMB液和过氧化尿素液等量混合。 1M硫酸终止液：向85 ml蒸馏水中加入浓硫酸5 ml。 在准备了试剂盒、待检样品和外部对照质量管理血清后，按试剂盒说明书和质量管理及安全防护要求进行筛选检查。 在实验操作中安装必要数量的棒，在各孔中装入100l样品稀释液。 3个阴性对照孔，1个HIV-1阳性对照孔，根据需要再设置1个HIV-2阳性对照孔。 在各孔中加入50l标本和对照(对照后加入)，使孔充满样品稀释液，不溶解结合物球，不堵塞旋切机孔。 震动15S，372孵化605min。 用洗脸盆清洗6次(用洗液完全充满反应孔，静置3060S，共

13、清洗6次，清洗后的孔上及底部不得残留液体)。 在一个孔中加入100l基质液，不搅拌，室温下避光孵育302min。 每孔加入100l 1M硫酸停止反应，混合到一盏茶中。 以2h内置于酶标仪内，以单波长450nm或2波长450/630nm测量OD值。 (3)实验结果阴性对照(NC )、HIV-1阳性对照(PC1 )、HIV-2阳性对照(PC2) NC必须为0.25，排除NC0.25的值，计算NC平均值。 NC边界范围：0.6倍NC平均NC1.4倍NC平均。 满足可以利用2个以上的NC这一条件的实验成立了。 PC1-NC平均值0.4、PC2-NC平均值0.4 Cut off值=阴性对照平均值0.10

14、0表示Cut off为阴性、Cut off为阳性(4)以上的报告：对于表示阴性反应的样品，表示能够从实施检查的实验室输出HIV抗体阴性报告的呈阳性的样品、3.4、(4)检查点1、筛选检查阳性不出阳性报告书2，按照试剂说明书操作，不得随意变更。 3 .留心防止交叉污染。 4 .严格遵守实验室标准操作规程(SOP )。 (5)检验程序及程序流程图1、检验试验标本检验合格后，使用检验试剂进行检验，在显示阴性反应的情况下，对于显示报告HIV抗体阴性的呈阳性的标本，需要反复进行检验。3.5、2、反复检验是用不同于原试剂的原理或不同厂家的试剂来筛选显示呈阳性的标本。 如果两种试剂的再测定均为阴性反应，报告HIV抗体阴性的均显示呈阳性，或为阴阳一阳时，则需送到艾滋病确认实验