毕赤酵母的基因表达及其初步纯化.ppt

1、毕赤酵母中4A15基因的分泌表达和初步纯化，Alade，毕赤酵母的优点，1，表达效率高，遗传稳定性2，结构简单，表达，第一，实验材料，DH5，pPICZA，GS115，TOP10，pQE4A15 pMD18T载体，Pfu高保真度酶，T4DNA连接酶，限制性内切酶。PCR产品纯化套件、质粒提取套件、绵羊抗小鼠IgG -HRP、增强HRP-DAB、基质着色套件、毕赤酵母中基因表达的简单过程、4A15基因获取(PCR)目的基因的转化和克隆表达载体的构建然后删除Kex2后面的Ste3部位(Glu-Ala-Glu-Ala)，在下游引物(5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC AT

2、A 3)中引入终止密码子和xa酶切部位，获得目的基因4a 15-PCR 阳性殖民地分析：选择4个阳性群体进行了序列分析。序列正确的p4A15，3，表达载体的构建，双酶切基因片段p4A15，套件回收，双酶切质粒pPICZaA，回收大片段，面向方向的连接产物在低盐LB平板培养。选择抗性菌落提取质粒，双酶鉴定。5，毕赤酵母GS115电转换和鉴定5.1电转换，1，线性化限制内切酶BstXI单酶表达载体和重组质粒2，毕赤酵母GSll5受体细胞(转换条件：电压1 500 V，4毫秒)的电转换后培养，转化，5、PPICZaA 5 Aox1 primer和3 Aox1 primer为引物，以ppic zaa

3、5 Aox1 primer和3 Aox1 primer为模板，对5.2转基因者进行电转化和鉴定，提取抗性菌落的基因组DNA(参见方法Invitrogen酵母手册)1.5%琼脂凝胶电泳分析，6，目的基因在毕赤酵母GS115中表达，阳性克隆单种群在BMGY(包括酵母粉、甘油、生物素)培养基中摇晃培养(28，250 r/min培养到OD600)离心收集，每24小时向培养基中添加无水甲醇(在培养基中分泌诱导的表达产物)后，总浓度为1%。每24小时取上等额，上等额沉淀为丙酮，然后进行12%SDS-PAGE分析。GS115和GS115 /pPICZaA处理相同，下游SDS页面分析，6，重组蛋白识别和分析6

4、.1 Western blotting，丙酮沉淀后，12%聚丙烯酸凝胶电泳转移到硝酸纤维膜1% BSA密闭硝酸纤维膜上，1抗(A42抗体)，韦斯特氏Blot原理b，在页面分离蛋白质样品后，转移到固态载体(如硝化纤维素膜NC膜)，固态载体以非共价键形式吸附蛋白质，并能保持电泳分离的多肽类型和生物活性。，Western Blot原理c，将固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，对相应抗体进行免疫反应，对用酶或同位素标记的第二抗体做出反应，对基质上色或检测由电泳分离的特定目的基因表达的蛋白质成分。该技术还广泛用于检测蛋白质水平的表达。韦斯特莫氏操作阶段，1，蛋白质样品制备2，蛋白质含量测定3，SDS页面电

5、泳4，transmembrane 5，免疫反应6，化学发光，开发，丁英7，凝胶图像分析，6，重组每24小时向培养基中添加无水甲醇为1%。培养48 h。离心上等液，分别将固体硫酸铵添加到饱和度30% 40% 50% 60% 70%。离心收集沉淀，适量沉淀12% SDS-PAGE分析。蛋白质纯度分析、蛋白质分离纯化方法、Alade、4种分离纯化方法、1、根据分子大小分离纯化2、根据溶解性分离纯化3、根据电荷分离纯化4、利用配体特定亲和力分离纯化、1、根据分子大小分离纯化、主要透析、超滤透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法，结合盐析、盐流法去除无机盐。2，根据溶解度进行分离纯化，影响蛋白质溶解度的外部

6、条件，例如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等常用方法包括等电点沉淀和pH值调节，蛋白质的盐溶性和盐析，有机溶剂方法，水相萃取，反美剂萃取方法等。3，根据电荷分离纯化，蛋白质的电荷，即酸碱特性分离蛋白质的方法有电泳和离子交换色谱两种。离子交换色谱(IEC)是一种以离子交换剂为固定相的色谱方法，在可逆交换流动相成分离子和交换器上的平衡离子时，根据结合力大小的差异分离离子交换剂。负离子交换基质结合带负电荷的蛋白质，提高色谱柱上残留在洗脱液中吸附的蛋白质浓度，首先溶出色谱柱上吸附的蛋白质，离子交换色谱利用抗凝蛋白提取，4，对配体的特异性亲和力进行分离纯化，亲和层析利用对配体分子的蛋白质分子识别能力(即生物亲和力)建立的有效纯化方法亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离和纯化中也有相当广泛的应用。壳聚糖亲和层析的抑肽酶活性达到71 428