支原体检测SOP#严选内容

1、支原体检测SOP目的：制定支原体检验标准操作程序，确保检验工作正确。范围：本标准适用于本公司主细胞库、工作细胞库、病毒种子放置、对照细胞、病毒收获液、原液的支原体检测工作。根据：中国药典 2010年第3版一般规则3301支原体检测方法。一、培养法1，检测原理：在培养基中直接培养支原体，观察其生长和菌落形成。2、适用设备：灭菌锅、试管(带盖子)、10毫升吸管、1毫升吸管、37培养箱、3、测试阶段：(1)徽章的制造：购买徽章(2)徽章的灵敏度检测：36 到1 培养液变色，继菌种后，将培养液接种到检测对象培养基上，稀释10倍以上，将支原体稀释为10-7-10-9，接种到支原体培养基上。顾颉刚支原体稀

2、释以10-3-10-5接种于精氨酸支原体汤培养基上。在各稀释度中接种3台试管，从36 培养到1 ，7 14天，观察培养基变色的结果。接种后，将培养基管数的2/3以上变色的最高稀释度判定为该培养基的灵敏度。液体培养基的敏感度：肺炎支原体(ATCC 15531株)应达到10-8，支原体(ATCC 23714株)应达到10-4。(3)徽章预处理：使用支原体液体培养基和支原体半流体培养基(或支原体琼脂培养基)确认支原体。半流体培养基(或琼脂培养基)使用前，煮10-15分钟，冷却到56 ，然后放入火小腿血清(培养基：血清8: 2)，充分摇动青霉素，使其充分发挥作用。液体培养基不用煮，使用前也要用相同的成

3、分填充。(4)免疫训练：10毫升的支原体液体培养基各培养4个，相应的支原体半液体培养基各培养2个(冷却到36 1 )，试验0.5 1.0毫升的每个培养基36 到121天。接种后第7天，在4个支原体中，1个培养后，每个培养基被转移到相应的支原体半流体培养基和支原体液体培养基中，每个培养基被转移到2个，36 到1 培养21天，每3天进行1次观察。(5)结果判断：没有增长；资格；增长可疑倍复试增长资格；第二，DNA染色法1，检测原理：使用荧光染色剂(Hoechst 33258)检测支原体污染。染色剂和支原体DNA特殊组合后，在细胞核外能看到许多大小均匀的荧光点，证明细胞被支原体污染了。2、适用设备：

4、二氧化碳培养箱、荧光显微镜、6孔培养板(包括封面幻灯片)、灭菌锅、1毫升、10毫升吸管、无菌幻灯片、3、测试阶段：(1)测试试剂的制备：a，无菌HBSS:制造Hanks balanced salt solution，用0.22毫米无菌滤膜灭菌。不要用高压蒸汽灭菌。b、Hoechst 332358 stock solution(100 x):在100 ml无菌HBSS中，将5.0 mg bisbenzimide放入棕色瓶子，在室温下用电磁搅拌器搅拌30分钟，完全融化后，放入1.5ml的小离心管，储存在-20 。c，Hoechst 33258 working reagent:1ml Hoechst

5、 33258 stock solution，在室温下搅拌45分钟，放入棕色瓶子中，避免光，并用存储在4 的铝箔涂层。d，密封溶液：将22.2ml 0.1 ml/l柠檬酸盐和27.8 ml 0.2mol/L磷酸氢钠添加到50 ml甘油中，将pH调整到11mol/L NaOH，5.5(pH非常重要)，4e，固定溶液：冰醋酸和甲醇以1: 3体积比率混合使用前制造。(2)徽章和指示细胞：DMEM完全徽章没有DMEM抗生素徽章指令细胞：.培养Vero细胞： (没有支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞)Vero细胞可以长期培养或制造多个冷冻保存管，在考试前解冻培养。在测试前一周培养了Vero细胞。Ver

6、o细胞经过接种试验样品前一天的trypsin-EDTA溶液处理，以105cells/ml在6孔细胞培养板中培养，每个孔中添加0.5ml细胞悬浮液，每个孔中添加抗生素培养基3ml，37，5% CO2培养液。如果每隔一天认为增长良好，可以接种试验样品。(3)考试处理：细胞培养菌在没有抗生素的培养液进行至少一代的实验后，将提取充满细胞、3天没有改变液体的细胞培养液，接受检查。像这个毒瘤一样有毒性的物种，在指示的细胞形成病变并可能影响结果的时候，用未抑制的特定抗血清和病毒后或不会引起细胞病变的另一个指示细胞进行检查。选择用于测试检查的其他指示细胞必须是其试件不影响生长的细胞。(4)DNA染色在准备好的

7、指标细胞培养板上放入试验产品(细胞培养上清液)2毫升(毒瘤或其他试验用最低1毫升)，将5%的二氧化碳培养箱在36 1 培养3 5天。指示至少培养一次细胞培养物，为最后一次继代培养，培养带盖幻灯片的6孔培养板3-5天。吸收培养液，在每个孔中加入以5ml 1: 3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10分钟后吸收固定液。重复上述步骤，干燥10分钟。在每个孔内放入5ml Hoechst 33258工作站解决方案，在室温下静置30分钟。吸Hoechst 33258染液后，用5ml无菌水洗3次，吸干水分后，盖幻灯片在空气中干燥干净的载体幻灯片，再取一滴密封液，分别盖在盖膜上。荧光显微镜观察。观察细胞核外是否出现蓝色荧光小点或丝状点的荧光物质。实验制剂用无抗生素培养基代替2ml，用同样的方法作为阴性对照。用2毫升的试验标准菌株代替检测用品，方法相同，用作阳性对照。(5)判断结果语音对照组-无生长(只有Vero细胞的核用荧光显