生物技术基因工程常用工具酶(课堂PPT)

1、1,2 基因工程常用工具酶,2,基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可少的工具。 取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶限制性核酸内切酶 将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶DNA连接酶。 目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分子克隆操作，拓宽了基因工程的研究领域。,3,世界大型工具酶生产厂商：（1） Novo Nordisk （诺和诺德公司，丹麦）（2） Gist Broccdes（荷兰）（3） Cultot （科特公司，芬兰）（4） Genencor International （杰能科公司，美国）（5） So

2、lvay （苏尔威公司，比利时）（6） Clr Hansen （汉森公司，丹麦）（7） Rhone Ponlene （罗兰，普朗克公司，法国）（8） Quest （荷兰）,4,2.1 限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶（restriction endonucleases）：简称工具酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离出来。 仅II型限制型核酸内切酶已有2000多种，可以识别200多个不同的DNA序列。,5,2.1.1 限制性核酸内切酶的发现,2.1.1.1 细菌的限制修饰作用 1952年，Luria

3、和Human， 1953年，Bertani和Weigle 发现细菌的限制（restriction）现象： E.coli k Phage（k） E .coli BE .coli B 限制 （k）,感染,不感染,6,噬菌体侵染细菌,7,仍有少量phage (K)可在 E. coli B中生存，是因为这些phage对自身进行了修饰。,大肠杆菌K,大肠杆菌B,普通的phage (K),修饰的phage (K),10-4（限制作用）,1,1,8,2.1.1.2 R-M系统,细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制修饰系统(R-M Restriction-modification

4、system)。 R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。,9,2.1.1.3限制性内切酶的发现,1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对D

5、NA分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。,10,2.1.2 限制性核酸内切酶的分类,根据限制性核酸内切酶的限制修饰活性、相对分子量大小、酶蛋白结构、切割位点及限制作用所需的辅助因子等，将限制性核酸内切酶分为三类：I型酶，II型酶，III型酶。,11,2.1.2 限制性核酸内切酶的分类,12,EcoR I,Escherichia,属名,Coli,种名,Ry13,株系,编号,若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。,2.1.3 限制性核酸内切酶的命名,13,2.1.4 限制性核酸内切酶的活性单位,50L Buffer中，含1g底物DNA，于最适反应

6、条件和温度下，保温1小时，能使1g DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。 buffer （pH=8.0） ： 50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇 100g BSA/ml （DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白）,14,2.1.5限制性核酸内切酶的切割特点,在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单链延伸末端。,15,识别序列,绝大多数的型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特

7、定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。,A B C C B A,A B C C B A,A B N B A,A B N B A,或,16,EcoR ,5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5,不同核酸内切酶的特异识别位点,17,A A G C T T,T T C G A A,A,B,C,D,DNA,DNA,Hind,Hind切割位点,核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用,18,三种酶切末端,平齐末端（如Sm

8、a、Alu、Hae） 5粘性末端（如EcoR ） 3粘性末端（如Pst ）,5-G- -AATTC-3,3-CTTAA- -G-5,19,同裂酶和同尾酶,同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。 如：Hpa和Msp均可切割C CGG。 同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。,20,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,Bcl,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl,BamH Bcl Bgl三种酶可产生相同的5GATC粘性

9、末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。,21,星活性,限制性内切酶识别特异性放宽。 EcoR在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在AATT处发生切割，EcoR这种特殊的识别能力叫做星活性，用EcoR*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。 影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。,22,2.1.7 限制性核酸内切酶的应用,重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化

10、受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究,23,2.2甲基化酶(methylase),类R-M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶。 甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)，用来修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶（C）5-氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限制性内切酶识别而免于切割。,24,甲基化酶分两类： 维持性甲基化酶：用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。 构建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶。 用甲基化酶进行甲基化的作用 封

11、闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。 构建新的酶切位点,25,2.3 DNA连接酶（ligase）,能够催化DNA中相邻的3-羟基和5-磷酸基团末端之间形成3, 5-磷酸二酯键的酶。 T4 DNA连接酶：可连接带匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。 大肠杆菌DNA连接酶：只能连接带匹配粘末端的DNA分子。,26,2.3.1 DNA连接酶作用特点,DNA连接酶需要在一条DNA链的3末端具有游离羟基（OH），另一条链5末端具有磷酸基（P）时才可发挥作用。 3OH和5P需彼此相邻，且各自位于与互补链上互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端。 DN连接酶不能连接单

12、链DNA分子，只能连接双螺旋DNA分子的一部分。,27,DNA连接酶只能封闭失去一个磷酸二酯键所出现的单链切口（nick），不能封闭失去一个或数个核苷酸所形成的缺口（gap）。 DNA连接酶反应时需要能量（NAD或ATP）。 切口： 失去磷酸二酯键 缺口：失去核苷酸,28,2.3.3 基因工程常用连接酶,2.3.3.1 T4噬菌体DNA连接酶 由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，分子量68KD，需ATP。 可以连接互补的粘性末端。如： 5ACGOH pAATTCGT3 T4DNA连接酶 3TGCTTAAp HO GCA5 Mg2，ATP 5ACGAATTCGT3 3TGCTTAAGCA5 反应系统

13、：ATP，TrisHCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP，pH7.5，415,29,也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反应速度较慢。 5CGAOH PCGTA3 T4DNA连接酶 3GCTP HOGCAT5 Mg2，ATP 5CGACGTA3 3GCTGCAT5 可以实现分子间或分子内连接。,30,AATTC G,G CTTAA,AATTC G,G CTTAA,5,5,5,5,(1) (2),AATTC G,G CTTAA,AATTC G,G CTTAA,5,5,AATTC G,G CTTAA,5,5,(a)分子间连接,(b)分子内连接,(1) (2),AT,G,C,T,A,T

14、A,G,C,T,A,T4连接酶,T4连接酶,31,2.3.3.2 大肠杆菌DNA连接酶 只催化有匹配粘性末端的DNA分子 需有NAD（氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）做能源辅助因子。 反应缓冲体系：TrisHCl，MgCl2，EDTA，DTE（二硫赤藓糖醇），NAD，BSA，pH8.0，415。,32,2.4 DNA聚合酶（DNApolymerase）,定义：在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3 -OH末端聚合DNA链的一类酶。 DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。 DNA聚合酶主要有三类：聚合酶(pol)、聚合酶(pol) ，聚合酶(pol)。其中聚

15、合酶参与DNA修复，聚合酶参与DNA复制。聚合酶是基因工程中的常用酶。,33,DNA聚合酶在DNA复制过程中的作用,34,DNA聚合酶和的比较,35,主要的DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶(全酶) Klenow片段 TDNA聚合酶(TPhage感染的E.coli) 修饰的TDNA聚合酶(测序酶) TaqDNA聚合酶(耐热) 反转录酶,36,2.4.1 大肠杆菌DNA聚合酶I,有大肠杆菌polA基因编码的一种单链多肽蛋白质， MW = 109，000 D，约有1000个氨基酸，分子中含有一个双硫键，一个硫氢键，还含有锌离子，椭圆型结构。,37,2.4.1.1 DNA聚合酶I催化合成DNA互补链

16、的条件： （1）四种脱氧核苷酸dNTPs和Mg2离子； （2）带有3OH游离基团的引物； （3）单链或双链模板(DNA或RNA)； 2.4.1.2 DNA聚合酶I 具有三种酶活性： （1）53聚合酶活性；（2）53外切酶活性；（3）35外切外切酶活性。,38,（1） 53聚合酶活性： 以单链DNA为模板，在DNA引物3-OH末端聚合上脱氧核苷三磷酸。,39,（2）53外切酶活性 以双链DNA或RNA和DNA杂交体为底物，从5端降解双链DNA或RNA和DNA杂交体的RNA部分。 只对DNA配对部分即双链的磷酸二酯键有切割作用。,40,（3）35外切酶活性 从3OH端降解DNA。,41,2.4.1

17、.3 DNA的切口平移（nick translation）,DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途是通过DNA切口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。此时， DNA聚合酶的5-3核酸外切酶活性和5-3聚合酶活性同时发生。,5-3外切酶活性,5-3聚合酶活性,未经标记的核苷酸,经标记的核苷酸,42,2.4.1.4 DNA杂交探针的制备,5 3,3 5,5 3,3 5,*,*,*,*,*,*,*,*,(a),(b),(c),(d),(e),(a)双链的DNA分子,(b)带有3-OH末端的单链缺口,(c) pol从5-P移去一个核苷酸,(d) pol将32P标记的核苷酸参入取代被移去的

18、核苷酸,(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5-3方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链,43,探针（probe）,探针：用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针。 标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。 分子杂交：探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecular hybridization）,44,2.4.2 Klenow,来源： E.coli DNA Polymerase经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970,DNApol,枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶,C 端(76kd) + N 端（36kd）,Klenow 5 3聚合

19、3 5外切,5 3外切,45,Klenow,用途 填补限制酶的5-粘性末端为平齐末端 3-末端标记 Klenow 在无底物时只进行3 5外切；有底物存在时则聚合。可用32PdNTP对3凹端进行标记。 在cDNA 克隆中，合成cDNA第二条链 应用Sanger双脱氧法进行DNA测序。,5CC 3GGAATT,5CCTTAA3 3GGAATT5,Klenow,46,2.4.3 Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus),来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种 结构：单亚基MW=94000d。 活性：聚合最适温度为75-80，不具35外切酶活性，具53外切活性 。 用途： PCR反应。 测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。,47,2.4.7 反转录酶（reverse transcriptase）,定义：以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶。 用途： （1）逆转录； （2）对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了在反转录完成后再用Na