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文档简介

1、a,1,实验三：PCR扩增检测乙肝病毒,a,2,乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我国发病率很高 ，HBV的检测极其重要。 HBV DNA存在就可以引起乙肝的传染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复制的发动机 。,a,3,PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察及预防研究工作最理想的方法之一。,a,4,一、实验目的 1.掌握PCR技术扩增的原理 2.熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作过程。,a,5,二、实验原理 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction) 简称PCR,是在体外条

2、件下利用DNA聚合酶、催化一对引物间的特异性DNA片段合成的基因体外扩增技术，它包括三个基本过程：,a,6,1.变性：加热使双链DNA变为单链 2.退火：急速降温使引物和互补模板 在局部形成杂交链 3.延伸：耐热DNA聚合酶按5 3 方向催化以引物为起始点的 延伸反应,a,7,模板DNA,高温变性,低温退火,引物,适温延伸,经过25-35次循环后，目的片段扩增2n倍,两条子代DNA,一 次 循 环,Tap酶,5,3,3,5,3,5,5,3,5,3,a,8,三、主要器材及试剂 1.主要器材：,9700型PCR仪,电泳槽、电泳仪,a,9,紫外分析仪,台式高速离心机,a,10,2.主要试剂：,a,1

3、1,四、操作步骤 1.标本处理：取患者血清40l，加入DNA提取液40l，沸水浴10分钟，10000转离心5分钟，取上清液4l做PCR反应。,a,12,2.加样： 加入提取好的标本4l，6000转离心10秒。,a,13,三个扩增步骤温度及时间,循环次数：25次,3.PCR仪上扩增：,a,14,PCR仪上扩增,加入标本,离心,6000转离心10秒,a,15,4.电泳检测： 制备2%琼脂糖凝胶,2%琼脂糖的制备：,电泳槽的准备：,称取 0.8g琼 脂糖,40mlTBE 电泳缓冲液 （PH8.0) 煮沸溶解,加入,冷却,60左右,加入 溴乙啶 EB20l,倒胶,a,16,加样：取扩增后的产物10 ul点样于凝胶孔,取样,点样,a,17,电泳：点样端接“-”，稳压，50V，电泳30分钟。 五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色条带则为HBV阳性,HBV阳性,HBV阴性,HBV阳性对照,HBV阴性对照,正极,负极,点样孔,a,18,五、注意事项 1. 试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充分融化离心。 2. 反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从反应管底部吸液。

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