MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用.ppt

1、MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用，2、3、1，现有细菌检测方法及其缺陷，4，现有细菌检测方法及其缺陷，经典方法的初步分类：菌落形态、显微镜检测以及革兰氏染色、氧化酶催化剂和触觉酶催化剂等趋势试验。 鉴定属或种：根据细菌生长代谢过程选择具有化学基特征的大姨妈生化反应、培养基生长状况。 尽管一些缺陷的生化实验可以在几分钟内完成，但大多数变种、培养的微生物标本通常需要得到完整的鉴定报告，而一些苛性氧菌和生长缓慢的细菌则需要更长时间。 操作繁杂主观。 5、目前细菌检测方法及其缺陷，分子生物学方法1 .细菌核糖体(16S rRNA )基因排列分析： rRNA寡聚核苷酸序列是细胞球中最稳定的序列

2、，比DNA更稳定。 细菌中有3种rRNA、23S、16S和5S，其中16S rRNA因其核苷酸数适中、信息量大、稳定性高，易于提取和分析，已成为理想的细菌鉴定研究对象。 通过分析细菌rRNA序列的相关性，特定细菌种类的发生关系。 6、目前细菌检测方法及其缺陷，分子生物学方法2 .其他：鸟嘌呤与胞嘧啶盐化学基比例测定(G C mol% )，核酸的分子杂交实时荧光定量PCR缺陷：技术复杂、成本高、假阳性率高、不能自动化、高通量。 不适合临床检查！ 7、需要找到新的致病微生物快速诊断方法以满足临床需要，现有的细菌检测方法及其缺陷，8，2，底物辅助激光解吸电离飞行时间质谱，9，(1)质谱的基本概念，1

3、.0，质谱的基本概念，质谱法(Mass Spectrometry，MS ) :运动络离子(电荷两个核素质量相同，一个核素质量正好是另一个核素质量的整数倍。 分析这些个的络离子，可以得到化合物的分子量、化学结构、分解规律等信息。 1.1、原理：电离样品各组生成不同质荷比的络离子，在加速电场作用下形成络离子束，进入质量分析器。 利用电场和磁场产生相反的速度色散，络离子束中：速度慢的络离子通过电场后发生大偏转，速度快的偏转小的络离子在磁场中发生大偏转，速度快的偏转小的络离子在磁场中也发生质量分离，使不同质荷比的络离子聚焦在不同的点上，分别聚焦得到质谱质量分析的基本概念、1.2、仪器：利用运动络离子在

4、电场和磁场中偏转的原理设计的仪器被称为质量分析器或质量分析器。 质量分析器以电子方式检测络离子，质量分析器以络离子聚焦于摄影图片底板进行检测。 质谱法的机器种类很多。 单焦点质量分析器、双焦点质量分析器、四极矩质量分析器等。 后者的2种多被使用，多与瓦斯气体吉卜赛人格拉夫和电子计算机并用。 质量分析的基本概念、1.3、高真空系统：质谱计必须在高真空下工作。 高真空的阀门泵系统一般由前段泵(常用机械泵)、油扩散泵和分子透平机泵等构成。 扩散泵能够使络离子源保持在10-6 10-7毫银汞合金的真空度。 分析器有扩散泵，能够维持10-7 10-8毫银汞合金的真空度。 质量分析的基本概念、1.4、样品

5、注入系统：有直接注入、气体色谱法、液质联用、瓦斯气体扩散四种方法。 固体样品直接通过样品棒注入样品，加热使固体样品变成气体分子。 不纯的样本可以在分离出气相或液质联用之后通过接口引入。 液质联用/质量分析接口有皮带接口、直接液体接口、热喷雾接口。 质量分析的基本概念，1.5，络离子源：电离样品产生粒子电荷(络离子)束的装置。 最广泛使用的电离方法是电子碰撞法(EI )。包括化学电离(CI )、光电话距离、场电话距离、激光电离、火花电离、表面电离、x射线电离、场解吸附电离(desorption ionization )和快原子碰撞电离等。 其中，电场解吸和原子碰撞特别适合于测量挥发性小和对热不稳

6、定的化合物。 质量分析的基本概念，1.6，质量分析器：用质量负荷比的大小分离由络离子源形成的络离子束的装置。 其结构有单焦点、双焦点、四极矩、飞行时间(Time of Flight，TOF )和圆滚线曲线等。 质量分析的基本概念、1.7、收集器：分析器分离的同质量络离子可以用摄影图片衬底、法拉第筒、电子倍增管收集测定。 质量分析装置的极限分辨率和灵敏度等性能非常高，仅ug级和ng级的样品即可得到满脚丫子的质量分析图。 对于微量不纯的化合物，可以用气体色谱法或液质联用(对极性大的化合物)将化合物分离成单一成分，导入质量分析器，记录质量分析统计图表。质量分析的基本概念、1.8、应用：由于库吉卜赛人

7、格拉夫质谱计并用给出的信息量多，该方法可与计算机并用，进行质量分析图的标准化、背景和柱流失峰值的截断、元素体组成的给出、数据的积累和计算、多扫描数据的积累、未知化合物质量分析图的库检索、打印数据和绘图等工作质谱法特别是库特吉卜赛人格拉夫与计算机联用的方法，已广泛应用于有机化学、生化、药物代谢、临床、毒物学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、航天化学和国防化学等领域。质量分析的基本概念、提纯、络离子分离、分析、1.9、质谱仪：仪器种类繁多，应用特点各异。 在300左右可以气化的样品，用GCMs的分析优先，但是因为GCMs使用电子撞击法络离子化源(EI源)，所以得到的质量

8、分析信息多，可以进行库检索。 300左右不能气化，需要用LC-MS进行分析，这种情况下主要得到分子量信息，如果是串联质量分析，也得到结构信息。 在生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析得到分子量信息。 对于蛋白质样本，也可以测定氨基酸排列顺序。质量分析的基本概念、2.0、质量分析装置：质量分析装置的极限分辨率是重要的技术指标，高极限分辨率质量分析装置能够提供化合物组成式对结构测定非常重要。 双聚焦质量分析装置、傅里叶变换质量分析装置、带反射器的飞行时间质谱装置等具有高极限分辨率功能。 质量分析的基本概念，2.1，质量分析的基本概念质量分析装置，2.2，(2)基质辅助激光解吸电离

9、飞行时间质谱装置， 所谓23 MALDI-TOF-MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionizationtime-of-flightmassspectrometry )最近发展的质量分析技术， 通过搜索能够提供特征微生物蛋白质质量指纹图谱的特征质谱峰数据库，或与已知微生物的质谱峰进行比较，实现微生物的快速鉴定，具有迅速、高灵敏度、高极限分辨率等优点，可以微量分析核酸、蛋白质、多肽等生物大分子基质辅助激光解吸络离子化飞行时间质谱、2.4，2 .主要概念maldi (matrix-assistedlaserdesorptionization

10、 )是一种直接气化，络离子非易失性生物样品的质谱络离子化方式. 将被分析物的溶液和某基质溶液混合，使溶剂蒸发，使被分析物和基质成为结晶或半晶体，照射一定波长的脉冲激光，基质吸收激光能量后，均匀地传递给被分析物，使被分析物瞬间气化而络离子化。 使用基质的主要目的是保护分析对象物不被强激光能量破坏。 底物辅助激光解吸电离飞行时间质谱，2.5，2 .主要概念TOF(Time Of Flight )，飞行时间分析器：具有相同动能，质量不同的络离子，按飞行速度分离。固定络离子飞行距离后，质量络离子的飞行时间不同，质量小的络离子飞行时间短，首先达到检测器。 底物辅助激光解吸络离子化飞行时间质谱，2.6，3

11、 .基本原理：与微生物等量的底物分别放置在十位大板块上，溶剂挥发形成样品和底物的共结晶底物吸收来自激光的能量，使样品解吸，底物和样品之间产生电荷传递，样品分子电离通过飞行时间量测仪器，在到达量测仪器的飞行时间内即通过测定络离子质量负荷比(M/Z )测定络离子的分子量用专用软件进行比较，确定特异的指纹图像，确定基质辅助激光解吸络离子化飞行时间质谱，2.7，MALDI-TOF-MS原理图，基质辅助激光解吸络离子化飞行时间质谱，2.8，3， 基于MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用、2.9和细菌表面蛋白的分子量测定的MALDI-TOF-MS技术是一种全新的微生物快速检测和鉴定技术。 通过测定

12、细菌自身独特的蛋白质组成，应用质谱技术测定的蛋白质和多肽按分子量大小排列，形成独特的蛋白质组指纹图，在特征图峰进行菌株鉴定。 MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用、3.0、(1)简单的操作流程、1 .基质溶液的制备2 .试样的制备3 .质量分析4 .数据分析、MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用、3.1、基质溶液的制备：常用基质有图示的4种。 基质的种类可能影响质谱峰的形成。 以DHB 50 mg/mL、50%乙腈、0.1%三氟冰乙酸为底物，检测液体培养细菌，得出最佳质量分析图。 目前已经商品化的定径套基质溶液可以购买。MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用、3.2、样品

13、的制备(a )直接选择菌落的涂膜(75% 90%) (B )乙醇/乙晴处理(10% 20% )将临床样本接种在培养基(液体或固体)上选择菌落，或采取液体培养液，进行水和乙醇处理经过乙腈(11 )处理MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用，3.3，3 .质量分析在营销对象盘中加入一定量的样品上清点，干燥后点上等量的基质(如CHCA等)，干燥后用MALDI-TOF-MS脉冲激光MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用，ekin=1/2m v2，3.4，4 .数据分析用软件处理质量分析，进行主成分分析法，*横轴为质量负荷比(m/z )，纵轴为吸收峰强度，MALDI-TOF-MS在临床微生物

14、中的应用，3.5，maldi-ts 简单的操作流程，3.6 (二) MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围，细菌菌种检验多血清型细菌检验药剂耐受力不同菌株检验真菌的检验血液、尿及其他无菌液体标本的检验粪便标本的检验，3.7，MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围，1，细菌菌种检验eiii Seng等人研究了1066株分离细菌株，代表109种，84.1%能正确鉴定种子，11.3%只能鉴定属。 Bizzini等人对1371株的临床分离菌进行了分析，发现93.2%可以鉴定为种水平，5.3%可以鉴定为属水平。 鉴定种子的水中，MS和传统生化方法的平均一致率为95.1%。3.8、MALD

15、I-TOF-MS在细菌检验中的应用范围，1、细菌菌种鉴定在非发酵菌的基础上，将与人感染相关的3.7属的248株非发酵菌数据库化，测定8.0株的临床分离菌，与16S rRNA基因排列分析比较。 MS能鉴定6.7株(85.9% )，9株是鉴定错误，2株不能鉴定。 结论MALDI-TOF-MS能准确、反复地鉴定细菌，且在10min以内，不需要其他易耗品。 结果错误或无法鉴定是因为MALDI-TOF-MS数据库不完整，大部分差异是由于与系统数据库相关的分类学差异。3.9、2、多血清型细菌的鉴定传统细菌培养和生化鉴定方法有沙门氏菌属、大肠菌群、霍乱弧菌和副溶血弧菌等，不能分类与人体健康密切相关的多血清型

16、致病菌，需要进一步采用血清学和噬菌体试验等技术。 应用MALDI-TOF-MS技术鉴定和分类这些个多血清型细菌得到了初步应用，在沙门氏菌属分类中显示出良好的分类能力。 在MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围、40 3、药剂耐受力不同菌种的研究中，MALDI-TOF-MS在凝固酶催化剂阳性和凝固酶催化剂阴性的金黄色葡萄球菌美国范德瓦尔斯高等院校和英吉利曼彻斯特高等院校的研究中，取代了甲氧西林和头孢西丁纸法， 用MALDI-TOF-MS对甲氧苄啶耐受力金黄色葡萄球菌(MRSA )的抗菌剂检测细菌的各种获得酶催化剂，如内酰胺酶、甲基化酶催化剂、质子泵等。 MALDI-TOF-MS在细菌检测

17、中的应用范围为，4.1、4、真菌MALDI-TOF-MS可用于酵母菌、酵母样菌、丝状菌的鉴定。 Marklein等人的研究表明，250株临床分离的念珠菌有1.5种类，能准确鉴定出96%。 5、血液、尿及其他无菌液体标本采用血清分离管或氯化铵溶血标本，MS直接鉴定为79%的单一细菌感染。 MS对尿标本中细菌迅速、准确尤其是对大肠菌群，准确鉴定率为97.6%。 也有利用MS直接检测和鉴定其他正常无菌液体中的细菌的研究，正确的鉴定率为96%。 MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用范围为，对4.2、6、粪便标本从直接粪便选择培养基中生长的可疑菌落进行MALDI-TOF-MS分析，迅速鉴别和鉴定了

18、通常引起拉肚子的致病菌。 该方法可提前对2，3d多种非乳糖发酵正常菌群，如大肠菌群、柠檬酸杆菌、变形杆菌、阴沟肠杆菌、摩根菌等进行准确的检测。MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用范围、4.3、甲氧苄啶耐受力葡萄球菌(MRSA )、(3)maldi-tof-ms的应用实例、4.4，1 .制备基质溶液的最佳基质溶液为50mg/mL DHB 50%乙腈0.1%三氟冰乙酸(TFA ) 将制备样品的所有菌株以1%的比例接种到5mL LB培养基中，在3.7恒温培养震荡器下培养了8小时。 取6000g培养液，离心3min提取菌体，用75%乙醇溶液灭活，离心除去上清。 用高纯水洗涤菌体2次，最后用1mL高纯水悬浮菌体。 将细菌重混悬剂1L和基质溶液1L混合到一盏茶后，采集样品，在室温下干燥。 MALDI-TOF-MS的应用实例、4.5、3 .质谱采用配置有脉冲氮激光(337nm )络离子源的Ultraflex串联质谱仪、线性模式、正络离子光谱测量、加速电压控制在22kV。 每个样品随机选取