第三章：酶的分离纯化.ppt

1、第三章：酶的分离纯化,酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度。,要点：,酶主要还是蛋白质，能用于蛋白质的分离纯化方法通常可用于酶。 要尽量减少酶活损失。 要分清是胞内酶还是胞外酶 根据酶的用途采用不同的方法,3.1 酶分离纯化流程,酶原液,否,胞内酶,细胞破碎,提取,分离,浓缩,干燥,预处理,细胞分离,3.2 酶纯度的评价,总活力的回收率 比活力提高的倍数 酶的纯度,实用价值,侧重科研,3.2.1 酶总活力回收率与提纯倍数,1 总活力的回收率：反映提纯过程酶活力的损失情况。 总活力的回收率纯化后总活力/纯化前总活力*100% 2 提纯倍数：反映纯化方法的效率 纯化倍数纯化后的比

2、活/纯化前的比活,示例：,腺苷酸激酶纯化表（6kg猪肉）,纯化步骤 总体积 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率,抽提 16600 43500 0.0413 0.95 1 100,ml mg katal katal/kg %,调pH 15700 11200 3.25,层析 1380 1716 13.02,凝胶过滤 211 462 43.17,结晶 - 344 46.5,3.2.2 酶的纯度检验,注意标明使用何种方法检验的. 不同方法检验的纯度可能不一致。如电泳纯、层析纯、HPLC纯。,常用的检验酶纯度的方法,方法特点,超速离心 检测杂质5%时不太满意，不适合络合解离体系,电泳 必须在多种p

3、H值下进行，单一pH两种酶可能一起移动,SDS电泳 可测出分子量，多亚基时会出现多条区带,等电聚焦 检测杂的极灵敏方法，有时会出现表观异质现象,N末端分析 只适用于一条肽链,免疫技术 高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦,3.3分离与纯化,分离（提取）：在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。 纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶，再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一性，将酶纯化。,3.3.1 细胞破碎的方法,机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法 P72-73,3.3.2酶提取的方法,盐溶液提取法 酸溶液提取法 碱溶液提取法

4、 有机溶剂提取法 p76,根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。,3.3.3影响酶提取的主要因素,1提取目标:提高提取率减少酶活损失。 1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在010，对于稳定性高的酶提高温度有利于提取。 2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但pH不宜过高或过低，防止酶失活。 3) 提取液用量：用量增加，提取率增加但分离成本提高。一般为原液的3-5倍 4) 添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶或抗氧化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损失。,1分离过程中新设备、新技术的应用会取得事半功倍的效果。如离心机、过滤机的选择。采用膜分离技术等。 2. 浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失

5、活，同时可添加一些保护剂以减少酶失活。,提取时的注意事项,3.4 沉淀分离,沉淀分离方法： 盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 复合沉淀 选择性变性剂沉淀,3.5 离心分离,借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小密度的物质分离的技术。 常用于：细胞收集、细胞碎片和沉淀的分离及酶的纯化。 选择离心分离注意选择适当的离心机、离心方法离心条件。,3.5.1 离心机的种类和用途,常速离心机：转速在8000r/min内,高速离心机：转速在1x1042.5x104r/min内,高速离心会导致温度升高因为防止酶等失活，有的装有冷冻装置。,超速离心机：转速在2.5x1048x104 r/min内，都装有冷

6、冻装置，和其它一些控制系统。,常速离心机,高速离心机,超速离心机,超速离心机又可分为制备用超速离心机，分析用超速离心机，分析制备两用超速离心机。 分析用超速离心机可用于样品纯度的检测、沉降系数和分子量的测定。分析用超速离心机一般都装有光学检测系统，自动记录仪和数据处理系统等。,沉降系数,单位离心力作用下，粒子的沉降速度。 Svedberg,S=1x10-13s,角速度，t2-t1离心时间，X1,X2粒子距中心轴的距离,3.5.2 离心方法的选择p82,常速和高速离心机只要选择合适的速度和时间就可以了而对于超速离心机离心方法可分为差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心。,1、差速离心,采用不同的

7、离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。操作简单方便，但分离效果较差，并使沉降的颗粒受到挤压。,2、密度梯度离心p82,是样品在密度梯度介质中进行离心的方法。能使沉降系数比较接近的物质得以分离。,01。n线性梯度离心,还有凹形梯度和凸形梯度。,不同大小和形状的颗粒在密度梯度溶夜中形成若干条界面清楚的区带,密度梯度系统,可在溶剂中加入一定的溶质制成密度梯度系统。要求介质有足够大的溶解度，不与组分反应，且不会引起分离组分的凝集、变性或失活。常用的介质有蔗糖和甘油。蔗糖的梯度范围为：浓度5%60%，密度为1.021.30g/cm3,3、等密度梯度

8、离心p83,当分离组分的密度i时下沉，而=i颗粒停留在该处形成区带。使得待分离的物质处于离心介质等密度处i形成区带的离心方法。要求溶液的密度比较大要等于分离组分的密度，因此常用銫盐如CsCl、Cs2SO4、CsBr等 当分离组分的密度已知则可直接用等密度离心而不用梯度。,3.5.3 离心条件的确定,离心力 离心时间 温度和pH：防止酶凝集、变性和失活。温度通常在低温下进行，高速和超速离心必须采用冷冻系统，防止发热。 pH应控制在酶稳定的范围内，同时要尽量不采用过酸或过碱溶液，避免对转子或离心机腐蚀。,3.6 电泳,主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、酶等电点测定及小批量酶的分离纯化。常用的是凝

9、胶电泳和等电聚焦电泳。,电泳仪,3.6.1 凝胶电泳,以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。同时具有电泳和分子筛的双重作用。常用的支持体是聚丙烯酰胺凝胶(PAGE),连续凝胶电泳,不连续凝胶电泳：具浓缩作用,浓度梯度凝胶电泳: 用于测定球蛋白的分子量,SDS-凝胶电泳,1 不连续凝胶电泳,分成三层：样品胶、浓缩胶、分离胶。特别适用于稀溶液的分离。,-,+,2、SDS-凝胶电泳,制备凝胶时加入12%的十二烷基硫酸钠，制成SDS-凝胶。,3.6.2 等电聚焦电泳,在电泳系统中加入两性电解质载体,通电后在电场中形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。待分离组分在电场作用下移动到与其等电点

10、相当的pH位置上，使不同等电点的物质分离。,特点,分辨率高：可分开等电点相差0.010.02pH的蛋白质。 克服了电泳的扩散作用：时间越长区带越窄。 与点样位置关系不大：不论点在何处都可以聚焦到等电点位置。 重现性好 可分离很稀的样品 可准确测定蛋白质或多肽的等电点。,对等电点处不溶解或发生变性的蛋白质不适用,载体两性电解质要求p107,在等电点状态下有足够的缓冲能力，以便控制好pH梯度。 在等电点状态下有足够的导电能力，以便使一定的电流通过。而且要求各个等电点不同的两性电解质有相同的导电系数，使整个体系导电均匀。 比待分离组分的分子量小，以便在等电聚焦后易于分离。 化学组分与待分离组分不同，

11、且与样品中各组分不相互作用 。,等电聚焦电泳槽,3.6.3 毛细管电泳,主要优点,分析条件选择简便及分离的高效性。当改变2或3个数据时,(例如缓冲剂的pH值,或浓度值)可以在很大程度上提高分离的效率和选择性。在强电场的作用下,毛细管内液体分离的效率可达到2,000,000理论的塔板数(同液相色谱法相比,色谱柱的分离不超过60,000-100,000理论的塔板数)。,可靠性.由于此方法不使用固体物质,排除了毛细管老化的可能性,同时不与样品发生任何物理化学反应,从而避免了毛细管的经常性损耗,降低了毛细管电泳仪的成本。 时间短,价格低廉。毛细电泳的高效分离,使样品的准备工作降到最低程度,节省了试剂的

12、消耗。同时,由于在毛细管中直接进行检测,致使分析时间缩短为10-15分钟。,3.7 酶的结晶,结晶是溶质以晶体的形式从溶液中解析出的过程. 结晶意义:可以提高纯度,获得较高纯度的酶 ;同时有些物理性质的研究需要结晶的酶。如X射线晶体衍射测结构。 结晶条件：通常要求酶的纯度足够，且不同的酶对纯度的要求不一样；酶的浓度合适，太低不产生结晶、太高晶体小不易长大。还要控制好温度、pH、离子强度等。,常用的结晶方法：,盐析结晶法：加盐降低溶解度,有机溶剂结晶法：加有机溶剂，含盐少，时间短，但要注意防止变性。,透析平衡结晶法,改变溶解度,等电点结晶法: 调节pH达到PI,注意防止局布过酸或碱常配合透析平衡、扩散法。,温度差法结晶,金属离子复合结晶法,透析平衡法,3.8浓缩与干燥,一浓缩,从低浓度酶液中去除部分