植物基因工程

1、植物基因工程,Part I 植物基因工程概论,The contributions of different methods in raising crop out-put (FAO, 1998).,从1983年第一例转基因植物（烟草）问世，到1993年，世界上转基因成功的植物就已突破60种；从1986年首批转基因作物获准进行田间实验，到1993年获准进行田间实验的转基因植物已达1025例，涉及38种植物。这十年是植物转基因的研究走向应用的重要准备阶段。,83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02,First trans

2、genic plant,Delay-ripening tomato Commercialized in the US,First field tests,Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized,GM maize approved by EU,First Bt corn plants,Rotting resistant tomato approved by FDA,1. 植物基因转移的主要方法,载体为媒介的转移方法 农杆菌介导的转移方法 病毒为载体的转化方法 直接转移技术 基因枪法 花粉管通道法 原生质体法 PEG介

3、导的转化法,2 农杆菌介导的转化方法,根癌农杆菌 根癌农杆菌是一种土壤微生物，在双子叶植物中导致冠瘿病的形成。冠瘿瘤的形成是由于Ti(tumor inducing) 质粒导致的。,2.1 根癌农杆菌,农杆菌有四种类型： 章鱼碱（octopine） 胭脂碱（nopaline） 农杆碱（agropine） 琥珀碱（succinamopine）,2.1 根癌农杆菌,Ti 质粒分为4个区 T-DNA区 Vir区（Virulence region) Con区（region encoding conjugation) Ori区（origin of replication),2.2 转化,利用Ti质粒将目的

4、基因引入植物 将基因插入T-DNA中，细菌就可以将它整合到植物的染色体DNA中。 问题： Ti质粒分子太大。 200kb的分子中无法找到单一切点的酶。,2.2 转化,双元载体策略 共整合策略,2.2 转化,双元载体策略(binary vector system) 双元载体系统是将T-DNA连在一个小质粒上，Ti质粒的其他的部分以正常的状态存在。,2.2 转化,共整合策略(cointegrative system) 利用以pBR322或相似的大肠杆菌载体，但含有一小部分T-DNA。基因可以插入小的质粒的单一酶切位点上。,2.2 转化,只有利用“卸甲”的Ti质粒才能获得转基因植株，而不形成冠瘿瘤。

5、 使用的载体必须是表达载体。,表达载体pBin19,2.3 发根农杆菌,发根农杆菌是另一种土壤农杆菌，含有Ri质粒。Ri质粒和Ti质粒非常相似，主要的区别在于Ri质粒的T-DNA转入植物后并不导致冠瘿碱的形成，而是形成毛发状的根。,2.4 病毒作为克隆载体,大部分的植物病毒的基因组是RNA而不是DNA。 在植物上已知有两种DNA病毒 花椰菜花叶病毒 二价病毒（geminivirus）,2.4 病毒作为克隆载体,花椰菜花叶病毒载体: 装载能力有限。 寄主范围窄，主要是芸苔属植物如芜菁、甘蓝和花椰菜等。,2.4 病毒作为克隆载体,二价病毒 自然中他侵染重要的作物，如玉米和小麦。 在侵染过程中，二价

6、病毒重新排列并删除部分序列，搅乱插入的DNA序列。 安全性。,3 直接基因转移,原理： 1984年发现，超螺旋结构的细菌质粒，可以重组整合到植物染色体内。,3 直接基因转移,代表性的方法是基因枪法 火药爆炸力 高压气体 氦气 氢气 氮气 高压放电,基因枪转化原理 基因枪转化前(A)及转化后(B)的主要部分示意图,3.1 基因枪转化法,转化率 转化率差异很大，一般在10-310-2之间。 McCabe在大豆上高达2% 有的报道仅有10-4,3.1 基因枪转化法,影响因素 金属微粒 DNA沉淀辅助剂的影响 DNA的纯度及浓度对转化率的影响 微弹速度的影响 外植体的内在因素,3.1 基因枪转化法,基

7、因枪转化法的缺点 成本高，转化率低 嵌合体比率大 遗传稳定性差,3.1 基因枪转化法,优点： 无宿主限制 受体类型广泛 可控度高 操作简便迅速,3.2 单子叶的植物基因转移,农杆菌一般只侵染双子叶植物不侵染单子叶植物。 植株的再生受到基因型的限制。,3.2 单子叶的植物基因转移,直接基因转移可以部分解决着一问题。标准的方法利用原生质体，再生的困难仍然存在。 基因枪转化提供了解决方法，直接将质粒DNA打到胚胎上。,花粉管通道法,转Bt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现,4 受体材料的选择 （1）良好的植物基因转化系统应具有的条件： 高效稳定的再生能力； 受体材料要有较高的遗传能力； 具有稳定的外植体来

8、源； 对筛选剂敏感。 （2）常用受体材料的类型： 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖细胞再生系统,Part II 基因工程策略,基因工程策略： 基因附加：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。 基因扣除：利用基因工程技术使一个或多个植物已经存在的基因失活。 反义技术 定点突变,1 基因附加,抗虫转基因植物的培育,1.1 Bt蛋白,苏云金杆菌的-内毒素 苏云金杆菌在孢子形成过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白称为-内毒素，其活性很强，要比有机磷毒性高80000倍，而且选择性很强。,表1 不同-内毒素 的杀虫范围,1.1 Bt蛋白,苏云金杆菌的-内毒素 早在190

9、4年即开始作为无公害的杀虫剂使用，但很容易降解。设想： 利用蛋白质工程，修饰其蛋白结构使其更加稳定。 通过基因工程赋予植物合成毒素的能力。,1.2 抗虫植物培育,将-内毒素导入玉米 北卡莱罗纳Ciba-Geigy实验室使用Cry1A(b)内毒素(1155aa)，其29-607位的aa具有毒性。 Ciba-Geigy研究小组使用了前648个密码子，人工合成了这一片段。原始基因中GC含量是38%, 人工基因的GC含量为65%。,1.2 抗虫植物培育,将人工基因连接到盒式载体上，后接一个来自于CaMV的多腺苷酸化信号 利用微粒轰击法将其引入玉米的胚中。 胚胎长成植株后，利用PCR法鉴定。,1.2 抗

10、虫植物培育,利用免疫技术鉴定转基因植株是否合成了-内毒素，结果显示人工基因确实具有活性。不同植株中产生的-内毒素数量不同，从250-1750ng/ mg总蛋白。,1.2 抗虫植物培育,转基因植株是否对玉米螟有抗性呢？应用两条标准来衡量： 害虫对植株总的危害 虫道的长度。 转基因植株表现了较好的抗虫效果，对照虫道长度40.7cm, 转基因植株虫道只有6.3cm。,2 基因扣除,以延长货架期的工程番茄为例进行说明 。,2.1 反义技术的原理,反义技术 将克隆的基因反向插入表达载体中，转录成mRNA后，与正常的mRNA是反向互补的。这种反向互补为反义RNA，缩写为asRNA。,2.1 反义技术的原理

11、,机理不完全清楚 正义和反义的RNA之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA会很快被核酸酶降解 。 反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合。,2.2 FLAVR SAVRTM的培育,表达载体构建 1980s中期，ICI种子公司生物技术部与Nottinghan大学合作，从正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5端获得了一个730bp的限制性片断，包含一半的编码序列. 将植物的多腺苷酸化信号连接到片段的头部，CaMV启动子连接到尾部，插入Ti质粒pBIN19中。,2.2 FLAVR SAVRTM的培育,植物遗传转化 pBIN19分子重组到根癌农杆菌中，用来侵染番茄茎段，转移到含kan的培养基中，再生形成完

12、整的植株。 转录后形成了反义RNA。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表达。,2.2 FLAVR SAVRTM的培育,转基因植物的分子鉴定： Southern杂交检测反义基因 Northern杂交检测反义基因的转录，利用只能与反义RNA杂交的单链探针。 反义基因对正义多聚半乳糖醛酸酶基因表达量的影响，通过与正义RNA的Northern杂交检测。结果表明，转基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表达量明显低于对照。,2.2 FLAVR SAVRTM的培育,转基因植物的鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低。,转化体的鉴定,1 标记基因,2 Southern杂交或PCR扩增,转

13、基因植株中CryIAc基因的PCR检测 PCR analysis of CryIAc in putative transgenic plantlets,转基因植株中CryIAc基因的Southern鉴定 Southern assay of CryIAc in putative transgenic plants,3 Northern杂交,4 Wertern杂交或蛋白质分析,5 表型选择,2.2 FLAVR SAVRTM的培育,表型鉴定 转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但存放时间明显延长。 意味着反义RNA虽然不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表达量，延缓成熟过程。,第三节

14、转基因作物的遗传特点,一、外源基因整合机制,（一）同源重组整合（homologous recombination） 外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生交换替代，并整合到受体染色体组上。 （二）位点特异性重组（site-specific recombination） 在两条DNA的特异位点上，通过位点特异性重组酶的作用对DNA进行特异性切割，实现外源基因的整合。,（三）转座作用（transposition） 通过体外重组将外源基因插入到转座子系统中，当携带有目的DNA片段的重组转座成分复制并整合插入到染色体其他区域时实现外源基因的整合。 （四）异常重组（illegimate r

15、ecombination） 异常重组整合是外源基因整合到植物基因组的最常见方式。,二、整合后的外源基因在植物体内的表现,共抑制：向受体植物种导入一个与受体内某基因同源的基因，导入的基因及受体内与它同源的基因表达都可能减弱的现象。 基因沉默：转基因植株由于外源基因的结构被破坏或者外源基因插入了染色体异染色质区域，出现外源基因序列不表达。,三、外源基因在后代中的遗传规律,第四节植物基因工程的应用,利用报告基因研究植物基因的表达与调控 利用转座元件克隆植物基因 利用转基因植物生产重组异源蛋白质 改良植物品种,生产异源蛋白,把植物改造成重要的药物或工业原料的生产工厂，即所谓的生物反应器 人的血清蛋白基

16、因转入烟草，生产医用血清蛋白； 蚕丝纤维基因转入棉花，生产动物纤维等,改良植物品种,延迟果实成熟 抗虫 抗病 耐除草剂 改变花型及花色 抗非生物胁迫 改善品质,在世界主要的切花中都缺乏蓝色系。经过十几年的研究蓝色康乃馨和蓝色月季的培育取得了显著的进展。,Suntory Ltd. Japan & Florigene Ltd. Australia,花色创新,花色的形成与花青素,花色形成的化学机理,色素的主要类型,类胡萝卜素carotenoid,类黄酮flavonoid,其它色素：甜菜色素betalain,花色素苷anthocyanin,黄酮、黄酮醇、噢哢等,花色素anthocyanidin,糖苷：

17、葡萄糖、鼠李糖、果糖等,蓝色花形成的主要途径： 除了液泡pH值、金属离子结合和辅助色素对花色的微调作用，增加花瓣中飞燕草色素苷的含量是使花瓣显蓝色的主要途径。所以通过调节飞燕草色素苷及其衍生物合成的关键基因，提高花瓣中蓝色色素的含量，是使花色变蓝的可行性途径之一。,花色素生化代谢途径及相关基因,DHM,DHK,DHQ,蓝色花形成关键基因的表达分析,I级 II级 III级 IV级 V 级,各基因在五个发育阶段的表达模式,pBSFH阳性苗花色的变化,CK,萼片,萼片,花瓣,雄蕊,心皮,3 基因工程应用,1 抗除草剂，高不饱和脂肪酸含量的转基因大豆 2 耐储藏西红柿 3 转富铁基因的金米水稻 4 转

18、人的血清蛋白的烟草 转Xa21基因抗白叶枯病的明恢63恢复系的选育 5 转Xa4, Xa5, Xa13及Xa21的多个抗性基因的累加系的选育 6 抗虫玉米、棉花 7 终结者技术 特殊性状的遗传利用限制技术,Teminator technology,种子特异启动子阻断DNA+毒素基因 重组酶，表达后可切除“阻断DNA”，其启动子是阻遏型的 编码阻遏蛋白的基因，四环素可与此阻遏蛋白结合使之失活。 终止子技术是美国Delta and Pine Land种子公司和美国农业部联合申请、经美国专利局1998 年3月批准的一项专利。,3 基因工程应用,我国基因工程产业化： 抗虫棉（鳞翅目害虫抗性高达80%以

19、上） 高抗黄萎病、抗白粉病和抗赤霉病及高产、稳产的系列小麦新品种。 转抗菌肽基因抗青枯病的马铃薯 抗玉米螟转基因玉米 抗白叶枯病转基因水稻 抗花叶病毒病的转基因番茄和辣椒,转基因安全性争论中的典型事件 普斯陶伊事件 斑蝶事件,第五节 转基因植物的安全性,普斯陶伊事件,早在1998 年,英国Rowett 研究所的Pusztai 宣称用转GNA 基因的马铃薯饲喂大鼠, “导致大鼠体重及器官重量严重减轻,免疫系统被损坏”。制造了著名的“Pusztai 事件”,进而在世界范围内引发了转基因作物安全性的争论。,斑蝶事件,1999 年5 月20 日Losey 等在Nature发表了题为“转基因花粉对大斑蝶幼虫有害”的研究报告。 饲养在撒有Bt 玉米花粉的马利筋叶片上的大斑蝶幼虫较之饲养在撒有非转基因玉米花粉或没有任何花粉的马利筋叶片上的幼虫取食量减小、生长延缓且死亡率更高。 Bt 玉米的种植面积增加了40