DNA测序的方法

1、DNA 测序的原理及方法,DNA 测序的原理 DNA测序的操作过程 DNA测序实例,Sanger法DNA测序的原理,使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链DAN等3种方法。引入双氧核苷三磷酸（ddTBP）作为链终止剂（Sanger等，1977 ），酶法DNA序列测定技术才得到广泛应用。,2，3ddNTP与普通dNTP不同之它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸。 在DNA合成反应混合物的

2、4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。,在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上.,DNA双脱氧法测序的原理及方法,点击查看相关网页,双脱氧法测序的原理,单击查看DNA测序的动画演示 DNA Seqamit.exe,常用测序方法,手工测序 读序长度: 约 300bp 同位素32P, 35S标记 结果通过人工肉眼分析,氩离子激光器测序仪 读序长

3、度: 500-700bp 可见荧光 Fam, Hex, Rox, Tamra标记 软件自动读序,红外激光器测序仪 读序长度: 1000-1400bp 红外荧光标记 软件自动读序,DNA Analysis Systems,IRD 800,Abs. Max.: 787nm,Em. Max: 807nm,Molar,Absorptivity: 200,000 m-1 cm-1,Quantum,Y,ield: 16.5%,荧光标记染料种类,IRD 700,Abs. Max.: 685nm,Em. Max: 705nm,Molar,Absorptivity: 170,000 m-1 cm-1,Quant

4、um,Y,ield: 50%,Independent Channels,Dyes are separated by 110 nm Detector filters eliminate signal crossover Lasers excite only one dye at a time,Contrast to 4 colors,No software interpretation of dye spectra With 4 colors it is difficult to distinguish between a strong signal in one color or a weak

5、 signal in a second color No dye mobility shift corrections,四色荧光分析检测,Detection Limits,检测效果分析比较,A,T,C,G,800 nm,Detector,Laser,800 nm,700 nm,Detector,700 nm,Laser,Signal Processing,Computer,电泳带型检测,700,800,测序电泳图谱,Channel 700,Channel 800,测序结果输出,长片段测序策略,BI-DIRECTIONAL SEQUENCING,5,3,3,5,IRD700,IRD800,Two

6、 Primers/Template,TTCAGAC-PRIMER PRIMER-AAGTCTG,2000 bases,SBS Options,Minimum overlap Largest single strand coverage Inserts 2 kb,Maximum overlap Confirmed sequence in one tube Inserts of 1200 bases,1,2000 Bases,1,1000 Bases,长片段的正反向测序,Side View,测序硬件,Long ReadIR DNA Sequencer,Gene ReadIR DNA Analysis System,BIOTECHNOLOGY DIVISION,Software,Multitasking Base ImagIR Software,3-Data=Accuracy,DNA测序的应用,Sequencing Mutation Screening Mutation Ana