2第二章 dna重组1.ppt

1、第二章 DNA重组,不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程。,第一节 天然DNA的制备,一、天然DNA的来源和用途,二、天然DNA的提取,准备生物材料,裂解细胞,分离和抽提DNA,（1）准备生物材料 选择生物种类； 选择DNA易提取和含量高的组织； 选择DNA得率最高的生长期。 如: 大肠杆菌质粒DNA：应在对数生长期后期。 植物DNA：选幼嫩植株或黄化幼苗（淀粉）。 肝脏DNA：要清除胆囊（酶）。,（2）裂解细胞 这步是关系到能否提取到DNA以及DNA得率高低和质量的关键步骤。 结构简单的原核细胞：用溶菌酶， NaOH和SDS ，煮沸，冰冻，超声波等方法； 结构复杂的动、植

2、物材料：首先必须粉碎（液氮冻结后研磨，或捣碎机、研钵直接粉碎），再参照裂解原核的方法。,液氮罐,正在倒出的液氮,（3）分离和抽提DNA 根据待提取的DNA的性质，使其与细胞内的其他组分分离，从中进一步抽提DNA。 提取总DNA：在裂解液中加适量酚氯仿异戊醇或氯仿异戊醇等有机溶液，使DNA与蛋白质分开，用乙醇或异丙醇处理水相，沉淀DNA，再离心。 提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌体的DNA：须先从裂解液中分离完整细胞器、病毒和噬菌体，抽提前必须经DNase处理，水解附着于其表面的其它DNA。,提取质粒DNA：调节裂解液pH12.6，所有DNA都变性沉淀，再调节pH至中性，质粒DNA

3、复性后从沉淀物中释出。 除RNA：用RNase水解除RNA， 分离抽提DNA最有效的方法：氯化铯梯度离心（氯化铯(CsCl)溶液中加适量溴化乙锭，紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光，但沉降系数明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区）,Flash1、视频1、2,举例 1、大肠杆菌源质粒DNA的提取 碱裂解法*： 原理：细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心去除后，就可从上清中回收质粒DNA。 (FLAS

4、H3),2、噬菌体DNA的提取 溶源周期 溶菌周期 提取DNA的原理： 先将溶源菌培养至一定密度，通过热诱导，使DNA从宿主染色体DNA上释放出来，再经过溶菌周期培养，获得大量噬菌体，从中提取线形的DNA。,提取过程： 溶源菌诱导培养 分离噬菌体 DNA的提取,3、氯化铯法制备植物基因组DNA 材料准备 细胞裂解 DNA分离抽取,三、DNA的纯化 1、氯化铯溴化乙锭连续梯度离心法 2、 离子交换层析法 3、琼脂糖凝胶电泳洗脱法 4、“基因纯”试剂纯化 5、从DNA样品中去掉EB 正丁醇（或异戊醇）抽提法 Dowex树脂层析法,四、DNA的浓缩 乙醇沉淀法 含一价阳离子的DNA溶液2体积无水乙醇

5、沉淀DNA离心溶于适量TE缓冲液或无菌水。 条件：-20，30 min以上；小于1kb或量较少时，于 - 70沉淀，或延长时间。,正丁醇抽提法 DNA溶液 1体积正丁醇混匀离心（1600 r/min 1min）弃上清重复至所需体积用水饱和乙醚抽提DNA溶液两次（除正丁醇）空气中蒸发乙醚。 聚乙二醇浓缩法 DNA溶液透析袋置高浓聚乙二醇溶液 4浓缩至所需体积。,视频3、4,谢谢,染色体DNA： 103 106kb 。是生物界含量最丰富的DNA资源，蕴藏着地球上极大部分的遗传信息。 用途：分离目的基因和基因表达调控因子；提供构建染色体载体和染色体基因整合平台系统。 病毒和噬菌体DNA： 种类很多，

6、可在原核和真核生物宿主内大量增殖。 用途：构建基因克隆载体，承载较大片段的外源DNA，经体外包装，导入受体细胞；其编码的结构基因可分离出目的基因及其表达调控因子。,质粒DNA： 存在于很多微生物细胞内，游离于胞质（即染色体外遗传物质）， 1几百 kb。有复制起始位点，能自我复制。 用途：构建基因克隆载体；含结构基因的质粒可分离目的基因和表达调控因子。 线粒体和叶绿体DNA：真核生物特有的染色体外遗传物质，含有呼吸作用和光合作用相关基因。 用途：分离目的基因和基因表达调控因子；构建克隆载体。,密度梯度离心,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。,单菌落,溶菌,阳离子交换剂 带负