石家庄-ELISA-讲座.ppt

1、酶联免疫吸附试验诊断技术,韩涛北京天之泰生物科技有限公司 2011年5月4日,主要内容,免疫检测基础知识 ELISA类型和原理 ELISA方法的特点 ELISA试剂组成 ELISA操作要领 ELISA检测质量控制 ELISA试剂盒质量评价 ELISA在动物疫病诊断中应用,一、免疫检测基础知识,抗原 抗体 抗原抗体反应 标记的免疫测定,抗原,抗原:能在机体中引起特异性免疫应答的物质,多为分子量大于5000的蛋白质。 半抗原:小分子化合物在与大分子蛋白质结合后才能引起机体产生特异性抗体，称为半抗原。 抗原决定簇：决定抗原反应活性的位点，或称表位。,抗体,抗体概念：能与抗原

2、特异性结合的免疫球蛋白(Ig)。 Ig分五类：与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。 其它有IgA、IgD和IgE 。,抗体,抗体的结构,抗体,抗体的产生,抗原抗体反应,可逆性：动态平衡 最适比例：带的概念 特异性： 敏感性：,标记的免疫测定,免疫酶 ELISA 免疫胶体金 免疫荧光 放射免疫分析 免疫电镜,二、ELISA实验原理,基本原理 抗原、抗体固相化 抗体（抗原）酶标记 基本类型 间接法 夹心法 双抗体夹心法 双抗原夹心法 竞争法（阻断法） 捕获包被法,间接法,PRRS,夹心法,CSFV-Ag,3、竞争法（阻断法）：既可用于测抗原，又可用于测抗体。,捕获包被法,用于感染的早期诊断,

3、如弓形虫感染 用于包被难以纯化的抗原,三、ELISA试验的特点,灵敏度高、特异性强 方法快速、简便 重复性好 自动化程度高，适合批量标准化检测 安全,四、ELISA试剂的组成,反应板（已包被抗原或抗体） 酶标记物（抗原、抗体、SPA） 酶的底物 阴性、阳性对照 样品稀释液 酶稀释液 洗涤液 终止液,反应板,包被的板 可直接使用 28干燥的条件下一般可保存12-18个月。,酶标记物,常用酶种类 酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 酶标记物 有催化活性、免疫活性 稳定性易受影响 保存 保存不

4、当，极易失活 加入等体积的甘油可冻存 早期ELISA 合适的缓冲液配成工作液在4-8保存，应避免冻融。,酶的底物,HRP的底物 邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD) 终止液：H2SO4 波长：492nm 四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB) 终止液：H2SO4 波长：450nm 终止液：HF 波长：650nm AP的底物 硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP） 终止液：H2SO4 波长：405nm,其它溶液,洗涤液 0.05%吐温-20 PBS，多为浓缩液。 终止液 常用2mol/L硫酸，有强腐

5、蚀性。 阳性对照品和阴性对照品 是试验有效性的控制品 作为判断结果的对照 参考标准品 定量测定的ELISA,五、ELISA使用的仪器,洗板机 分液机,五、ELISA使用的仪器,酶标仪,六、ELISA的操作要领,标本的采取和保存 试剂的准备 加样 保温孵育 洗涤 显色和比色 结果判断,样品的采取和保存,样品种类 体液、组织、分泌物和排泄物 样品要求 新鲜、无溶血、无沉淀、均匀 样品保存 在5天内可置于4，否则需冻存 避免反复冻融 加防腐剂长期保存,1、尽量避免溶血。 2、血清标本的制备：非抗凝自然凝固1-2小时，3000rpm离心15分钟。 3、血浆标本的制备：使用含有抗凝剂的采血管采血，颠倒混

6、匀放置一段时间后，3000rpm离心15分钟。 4、标本宜在新鲜时检测。若5天内检测，可使用冰箱2-8保存，超过一周时间测定，应于-20低温冻存。 5、反复冻溶会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存做多次检测，宜少量分装冻存。,二标本的采取与保存,试剂的准备,严格按要求准备试剂 用新制的蒸馏水或去离子水 自配缓冲液应用pH计测量较正 冷藏试剂应室平衡至温后使用 试剂盒中暂时不用的部分应及时放回冰箱,加样 1、尽量使用多道移液器。 2、用的微量加样器应注意保养并定期校正。 3、加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，注意不可出现气泡。 4、加样时避免样本溅出，如有样本

7、溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。 5、加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。,取样量准确,加液,及时更换枪头,保温孵育,温度 37、室温（20-25）和4 温度要恒定、准确 保温方式 水浴ELISA板底应贴着水面，加盖避免蒸发 保温箱为避免蒸发，用湿盒或用塑料贴封纸覆盖板孔 反应板不宜叠放,洗涤,目的 清除残留在板孔中没结合的物质 清除中非特异吸附于固相载体的干扰物 要求 洗涤要充分 最后排净 避免干燥,显色和比色,显色 是酶促反应，温度和时间应力求准确 显色反应避光进行 比色 酶标板的放置要正确 要选用产物的敏感吸收波长 以空白孔调零或双波长式测读可减少误差,结果判断,定量测定 定性测定,结果判断,定性结果判定 间接法和夹心法 目视法 计算法 计算S/P值 滴度值 竞争法 抑制率（%）= 阴性对照A值-标本A值 100% 阴性对照A值,七、ELISA试剂盒的质量评价,评价要点 以能否区分健康与疾