基因工程制药

1、第三章遗传工程制药第一，遗传工程药物第二，遗传工程制药基本技术第三，遗传工程制药案例。介绍工作检查资料，PPT，讲座论文准备中某遗传工程药物的生产过程。第一，基因工程药物，1982年第一种基因重组产品胰岛素来自美国Eli Lilly，很多科学家一直引诱和激励使用基因工程技术开发新药，到目前为止，已有近30种基因工程药物投入市场，带来了巨大的社会和经济效益。基因工程技术可以生产的药物和制剂包括：(1)免疫蛋白：多种抗原和单克隆抗体；(2)细胞因子：干扰素、白细胞介素、菌落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；(3)激素：胰岛素、生长激素、心脏等；(4)酶：尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白原

2、激活剂、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、chymosin、人溶菌酶、人，主要基因工程产品的开发、开发、上市时间、美国有56种生物制剂部分摘录(1)，产品公司主要适应症胰岛素EilLilly糖尿病人生长激素EilLilly儿童生长激素缺乏症(5)利用基因工程技术获得新化合物，扩大药物筛选来源。我国基因工程药物研究与开发：起步晚，基础低。1b基因工程干扰素是我国自主开发的国际先进水平的生物高新技术成果，1997年期间通过临床，获得国家级新药结业证书，成为“863”计划生物科技领域首次实现产业化的遗传工程药物。目前，我国已批准推出12种遗传工程药物和疫苗，研究开发也有10多种。2006年4月之前我国批准

3、的35种生物科技药品，胰岛素，1000磅牛胰10克胰岛素，200升发酵液10克，干扰素，1200升人血1升发酵液，患者2万美元/患者200300美元/患者，基因工程：基因工程、基因工程、重组体DNA技术、基因克隆或分子克隆，通过在体外切割、结合和结合其他徐璐生物的遗传物质基因，重新组合遗传物质，然后通过载体(质粒、噬菌体或病毒等)将其转化为微生物、植物或动物细胞，供体细胞，载体分子，外源DNA，外源基因，分离，酶切，酶切，连接，转基因扩增，目的基因向量，重组体，分割，切割，旋转，体，表，完整的技术路径，基因工程操作过程，1，分：分离目的基因2，切割：目的基因和载体的适当切割3，然后：目的基因和

4、载体的连接4，旋转：将重组DNA移植到受体细胞5，筛：筛选包含重组体的受体细胞6，表：目的基因在受体细胞中表达，然后基因工程约束的基本过程，获取目的基因构建质粒形成基因工程细菌或基因工程细胞工程细菌培养产品分离纯化基因工程药物的质量控制，目的基因获取，第一，酶解直接分离目的基因2，PCR直接扩增目的基因3，文库分离目的基因4，化学合成目的基因，酶解直接分离目的基因，Gagctc、aagctt、限制性内切酶在DNA克隆中的应用，PCR，聚合酶链反应，PCR的基本原理，模板DNA、PCR的基本原理，PCR反应条件PCR过程的特性，55，引物1，引物2，PCR的基本原理，PCR反应条件PCR过程PC

5、R的特征，引物1，引物2，Taq酶，Taq酶，PCR的基本原理，PCR反应条件PCR过程PCR的特征，第一轮结束，第二轮开始，PCR的基本原理，PCR反应条件PCR进程(PCR进程)的特征，Taq，Taq，Taq，PCR的基本原理，PCR反应条件PCR过程PCR的特征，第二轮结束，PCR的基本原理，PCR反应条件PCR过程(PCR)的特征，模板DNA，一轮放大，两轮放大，三轮放大，四轮放大，五轮放大，六轮放大，化学合成目的基因，什么载体？向量：是将外来的DNA导入受体细胞，实现自我复制和增殖的工具。向量概述，多复制站点，orig，复制起点，基因标记，Amp，polylinker，基因向量，向量

6、概述，三个重要特征：(1)分子量更小，只有2.7KB，增加外源DNA量。更高的拷贝数(每个单元格包含500-700个拷贝)。(2)包含易于检测外源DNA插入与否的标记基因Lac Z，可以利用蓝色白斑筛选的互补原理。(3)多克隆定位器(MCS)由人工合成的多个单酶切部分组成。(。质粒矢量，连接、转基因受体细胞，1，耐药性检测筛选方法，2，比色检测，IPTG:异丙基硫代半乳糖衍生物X-gal: 5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖，3，酶切图检测限制，4，PCR扩增检测，用PCR方法检测是否插入外源基因片段。优点：不需要适当的酶部位。缺点：假阳性率高。5，原位杂交检测根据插入DNA片段的序列，设计和合

7、成探针，检索包含目标基因的目的重组器。DNA同源序列间特异性互补杂交的该技术的基本理论基础，通过，6，序列进行双脱氧测序。双脱酸末端终止排序的基本反应：GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA，双脱产末端终止排序方法，Sanger双脱产终止方法排序过程，模板序列排序，读取，近年来，建立了利用荧光染料进行无放射性DNA测序的方法。用4种不同颜色的荧光染料分别标记4种不同的碱，然后在1个凝胶电泳通道中进行电泳，然后通过激光作用诱导荧光，达到了检测碱的目的。探测器将收集的信息传送到计算机，计算机自动显示或打印碱基序列。根据一次电泳，可以读取450个左右的碱基，36个凝胶也可以测量的3645

8、0个左右的碱基，排序速度大大加快。后来，发明了用毛细管电泳代替凝胶电泳，大大加快电泳的速度分辨率，实现自动移植和自动注射的方法。排序结果，7，利用外源蛋白检测，DNA中插入的蛋白质的功能或结构特性检测外源蛋白的存在。适用于表达载体检测。受体细胞的选择，大肠杆菌，外源基因在枯草杆菌细胞中的表达病毒中外源基因的表达外源基因在酵母细胞中的表达外源基因在昆虫细胞中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因在外源细胞中的表达。1，大肠杆菌表达系统大肠杆菌阴性杆菌是迄今为止最详细、应用最广泛的原核生物种类之一，是基因工程研究和应用中最完整、最成熟的载体系统。优点：繁殖快，培

9、养简单，代谢容易控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量内毒素，会引起人体的热源反应。2，枯草芽孢杆菌表达系统也被称为枯草杆菌，革兰阳性菌。优点：具有细胞外酶分泌调节基因的枯草芽孢杆菌以培养基高效分泌表达产物，大大简化蛋白质表达产物的提取和加工，大部分情况下，真核生物的异种重组蛋白由枯草杆菌分泌，具有自然的结构和生物活性。枯草芽孢杆菌不产生内毒素，没有致病性，是安全的基因工程细菌。枯草芽孢杆菌具有孢子形成能力，易于保存和培养。枯草芽孢杆菌也有大肠杆菌快速生长，新陈代谢容易调节，分子遗传学背景明显的优点。应用：成功表达了人类干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原及动物口蹄疫病毒VPI抗原等。在某

10、些生长条件下，大肠杆菌能积累某些生物大分子，它们在细胞内致密地团成膜，形成无膜暴露结构，这种不溶性结构称为包涵体。如果没有分泌表达和融合表达等特殊设计，外源基因占大肠杆菌表达的蛋白质的20%以上，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目标基因操作的关键是选择高度表达的载体。事实上，这种高表达率也是奉公体法的优点。在细菌细胞内，聚集状态和孔刘结合修饰蛋白不会进入复性过程，因此永远成为无活动蛋白。包涵体的蛋白质属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性(解除孔刘修饰和聚集体分散)复性工作。包涵体表达，融合型表达，外源性基因与受体细菌自身的蛋白质编码基因结合，用开放式阅读框架表达。这种

11、杂交基因表达的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，受体细菌的蛋白质部分通常在n端，异种蛋白质在c端。在DNA水平人工设计引入的蛋白酶切割部位或化学试剂特异性破坏部位，isoprotein可以从精制融合蛋白分子中体外释放并回收。n端：由原核基因多肽，c端：完全真核外生性基因。质粒基因产品，目的基因产品，N，C，切割，常用受体蛋白(由原核细菌表达的蛋白质)，(D3)受体蛋白的消融方法，化学中断法：溴化氰(cnbr)-met-(体点)-AA酶中断法：凝血因子Xa，蛋白酶活性，识别序列：IleGluGlyArg-(体点)，表达蛋白分泌，细胞质，外膜，内膜，周质，质粒，染色体，外热：蛋白质越过细胞

12、质，经过内外膜，到达培养液。分泌：蛋白质从细胞质横跨内膜到外周癫痫。，分泌蛋白表达的原理图标，常用大肠杆菌信号肽，碱性磷酸酶信号肽(phoA)膜蛋白信号肽(OmpA)霍乱弧菌毒素b亚单位(CTXB)。酵母表达系统，突变酵母提高重组异种蛋白质产量，基因工程细胞的扩增和发酵生产，(1)基因工程细菌的稳定性，(2)基因工程细菌的培养程序，(3)基因工程细菌的培养方法，(4)影响基因工程细菌培养的各种因素分析，(5)基因工程细菌的培养设备-生物反应器，1，基因工程细菌质粒的不稳定性，基因工程质粒的不稳定性与以下两个因素有关：(1)分裂不稳定：工程细菌分裂时不含质粒的后代的一定比例的现象。(2)结构不稳

13、定性：是指质粒中外源基因丢失，碱基重新排列，或缺失，工程菌的性能发生变化。失去质粒的细菌比含有质粒的工程细菌生长质量好，因此在竞争中最终取代工程细菌，进化成优势菌。最终导致蛋白质表达的减少。2，质粒稳定性分析方法，(1)适当稀释工程细菌培养液样本，均匀涂在不含抗生素的扁平培养基上，10-12小时培养，来自统计小肠的菌落数a；(2)然后随机选择100个群体，接种用抗生素标记的平板培养基，并培养10-12小时的群体数b；(3)计算B/A的比率。这个比例能反映质粒的稳定性。因为失去质粒的细菌不能在含有抗生素的培养基环境下正常生长。3，质粒不稳定的原因，1，分裂不稳定性-基因工程细菌是指在分裂的原生细

14、菌中不含质粒的现象。没有质粒的细菌变异体和概率大的工程菌的克隆量质粒的丢失概率和没有质粒的细菌的发生概率都与两个因素有关。(2)失去质粒的细菌，含有质粒的工程菌之间的竞争力大小。2、结构不稳定-是指质粒上外源基因丢失、碱基排出、缺失，最终工程细菌性能发生变化的现象。4，提高质粒稳定性的方法，(1)，阶段性培养法，(2)选择性压力，(3)温度，PH值，培养基成分，溶解氧的综合调控措施，(1)，阶段性培养法，工程菌的培养(2)第二阶段-开始诱导外源基因的表达。阶段1未表达外源基因，导致失去质粒的细菌发生的概率降低，工程菌的稳定性也提高。(2)，向培养基中添加抗生素，形成选择性压力。因为失去质粒的细

15、菌在含有抗生素的介质环境下不能正常生长。因此，通过添加抗生素，可以抑制没有质粒的细菌的生长。(3)，通过温度、PH值、培养基成分、溶解氧的综合调节措施，可以通过以下方法提高质粒的稳定性。(1)间歇供氧；(2)稀释率的变化；(2)基因工程细菌培养程序；1、摇瓶操作-温度值、培养基成分、氮碳比、表达产品积累对工程细胞的影响等解决工程细菌生长基本条件的摇瓶操作。2、操作训练罐-确定训练参数、确定训练方案和确定训练顺序。(3)基因工程菌的培养方法，1，饲料分批培养2，连续培养3，透析培养4，固定化培养5，高密度培养，1，饲料分批培养将种子放入发酵反应器中培养。是一种随着时间的推移，间歇地，或持续地补充新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。其目