HepG2细胞培养方法#优质严选

1、一种培养肝癌细胞的方法细胞复苏：材料：人肝癌细胞，RPMI-1640，胎牛血清，青霉素链霉素35厘米细胞培养瓶、无菌罗口离心管、无菌吸管、水浴箱、计时器、离心机和光学显微镜试剂制备：100毫升完全培养基：90mLRPMi-1640 10毫升胎牛血清1 PS，4保存步骤：1.将3毫升含10%胎牛血清的完整培养基加入到罗口离心管中。2.从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37的水浴中1分钟，直至融化。3.打开冷冻保存管，将细胞悬液吸入离心管，轻轻混合。4.以800转/分钟离心5分钟，弃去上清液。5.向细胞沉淀中加入4毫升完全培养基，转移到35厘米烧瓶中，在37进行常规培养，第二天观察细胞生长。细胞通

2、道和液体交换：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、聚苯乙烯、35厘米细胞培养瓶、无菌罗口离心管、无菌吸管、水浴箱、计时器、离心机和光学显微镜试剂制备：100毫升停止溶液：90mLRPMi-1640 10毫升小牛血清1 PS，储存于4步骤：1.对数生长期融合率为80%-90%的细胞可传代，用4毫升PBS洗涤两次。2.加入0.25%胰蛋白酶1毫升，在37孵育5分钟。3.加入3毫升终止溶液，吹掉细胞并切单，然后将其移至罗口离心管。4.离心5分钟，800转/分，弃去上清液。5.将完整的培养基加入到罗口离心管中，混合均匀并在不同的瓶中培养。6.细胞可以每隔一天用PB

3、S清洗一次，然后更换培养基。细胞冷冻保存：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜、PBS、聚苯乙烯、35厘米细胞培养瓶、灭菌罗口离心管、灭菌吸管、灭菌冻存管、水浴箱、定时器、离心机、过滤器和光学显微镜试剂的制备：10毫升冷冻液：7毫升完全培养基2毫升胎牛血清1毫升二甲基亚砜，混合均匀，过滤，4保存步骤：1.取出培养瓶中的旧培养基，加入4毫升PBS洗涤两次。2.将胰酶混合均匀，每瓶加入1毫升，在37孵育5分钟。3.向每个瓶中加入3毫升终止溶液，反复拍打细胞使其脱落并单个化，并将其移至罗口离心管。4.以800转/分钟离心5分钟，弃去上清液。5.向每个试管中加入

4、1毫升冷冻保存液，均匀混合细胞，并将它们移至冷冻保存试管中。细胞冻存管在-20保存2小时。6.细胞冻存管-80过夜。7.第二天转移到液氮中保存。细胞种子板：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、聚苯乙烯、35厘米细胞培养瓶、六孔板、无菌罗口离心管、无菌吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜和细胞计数器步骤：1.汇合率为80%-90%的HepG2细胞加入4毫升PBS洗涤两次。2.加入1毫升充分混合的胰酶消化，并在37孵育5分钟。3.向培养瓶中加入3毫升终止溶液，反复吹掉，使其成为单一溶液，并将细胞悬液转移至罗口。4.以800转/分钟离心5分钟，弃去上清液。5

5、.加入6.5毫升完全培养基，混合细胞，取15微升细胞悬液并计数细胞，每孔6孔板需要约5106-1106个细胞。6.将6毫升细胞悬液转移至6孔板，每孔1毫升，轻轻摇动悬液使其均匀完全覆盖，并在37继续培养。用棕榈酸和炎症因子治疗HepG2细胞；材料：RPMI-1640，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，甲醇，PBS，聚苯乙烯，棕榈酸(西格玛P9767)，肿瘤坏死因子-，牛血清白蛋白无菌罗口离心管、无菌吸管和EP管、过滤器、光学显微镜、仪表和过滤器试剂制备：1.牛血清白蛋白培养基：储存溶液：称取1克牛血清白蛋白，溶于10毫升RPMI-1640中，混合均匀，过滤，4储存工作溶液：在一瓶RPMI-1640

6、中加入2mlBSA储存溶液和PS，即浓度为0.2%，在4下储存2.棕榈酸储存溶液：称取13.92毫克棕榈酸(分子量278.41)，溶于1毫升甲醇中，即浓度为0.05毫升/毫升，辅以37水浴。将它分成5份，在-20下保存在电生理管中3.肿瘤坏死因子-储存溶液：称取10纳克肿瘤坏死因子-，溶于1毫升液体石蜡中，浓度为10纳克/毫升，分成10份，装于电生理管中，在-20下储存步骤：1.用低倍显微镜观察六孔板中细胞的状态，确保70%-80%的细胞在下一次实验前没有污染和杂质。2.将六孔板中的细胞用1微升的缓冲液洗涤，并将含有0.2%牛血清白蛋白的1毫升RPMI-1640加入每个孔中，并将细胞在无血清的

7、情况下培养24小时。3.细胞用不同浓度的棕榈酸处理24小时。(每组三个多孔)(1)对照组：用1毫升的牛血清白蛋白洗涤后，每孔继续培养1毫升牛血清白蛋白。(2)0.02摩尔/升棕榈酸： 1.2微升棕榈酸储存溶液2998.8微升牛血清白蛋白，每孔1毫升。0.04mol/l palmate : 2.4 ul棕榈酸储存溶液2997.6ul牛血清白蛋白，每孔1ml。0.08mol/l palmate : 4.8 ul棕榈酸储存溶液2995.2ul牛血清白蛋白，每孔1ml。0.16毫摩尔/升棕榈酸： 9.6微升棕榈酸储存溶液2990.4微升牛血清白蛋白，每孔1毫升。(6) 0.32毫摩尔/升棕榈酸酯： 1

8、9.2微升棕榈酸储存溶液2980.8微升牛血清白蛋白，每孔1毫升。4.不同浓度的肿瘤坏死因子-处理细胞24小时。(每组三个多孔)(7)对照组：每孔1毫升牛血清白蛋白连续培养。(8)5纳克/毫升肿瘤坏死因子-a : 1.5微升肿瘤坏死因子-a储存溶液2998.5微升牛血清白蛋白，每孔1毫升。(9)10微克/毫升肿瘤坏死因子-a : 3微升肿瘤坏死因子-a储存溶液2997微升牛血清白蛋白，每孔1毫升。(10)20微克/毫升肿瘤坏死因子-a : 6微升肿瘤坏死因子-a储存溶液2994微升牛血清白蛋白，每孔1毫升。(11)40微克/毫升肿瘤坏死因子-a : 12微升肿瘤坏死因子-a储存溶液2988微升

9、牛血清白蛋白，每孔1毫升。三唑法提取细胞总核糖核酸材料：1.RNAiso Reagent:购自Taraka(货号：D312)，100毫升2.氯仿、异丙醇和无水乙醇：中国分析纯3.0.1C-H2O，PBS和75%乙醇4.EP管、发射器、50毫升离心管、5毫升注射器、计算器、低温离心机和DEPC处理过的冰柜材料的酶去除：1.将与DEPC水混合的0.1c水灭活过夜，并用高压蒸汽灭菌。2.将极压管、滴头和离心管浸泡在0.1的水中过夜，用高压蒸汽灭菌，3.75%乙醇：75毫升无水乙醇25毫升0.1摄氏度水。4.新购买的异丙醇包装在DEPC处理过的50毫升离心管中，并在4下储存步骤：1.吸出培养基，用PB

10、S洗涤一次；2.将1毫升核糖核酸试剂加入100毫升培养瓶中(6孔板中有2个孔)，水平放置一段时间，使裂解液均匀分布在细胞表面并裂解细胞，然后用移液管枪吹掉细胞(约30次)；将裂解液转移到1.5毫升的电生理试管中，用移液管反复吹洗(建议用5毫升注射器泵送10次)；3.室温放置5min后，加入200 ul氯仿(RNAi so试剂：氯仿=1 ml 33 360 200 ul)，用力摇匀，然后室温放置5min，分层后离心，12000g，4，15min；4.将80%无色上清液倒入另一个干净的1.5毫升电生理管中(避免吸出白色中间层)，加入400微升异丙醇(异丙醇与上清液的体积比为1:1)，混合均匀，静置

11、10分钟；5.12000克，4，离心10分钟，此时试管底部可见沉淀；6.小心弃去上清液，沿管壁慢慢加入1毫升75%乙醇，轻轻将其倒置，使沉淀物漂浮，12000克。在4下离心5分钟，小心弃去乙醇，离心几秒钟后吸取剩余液体；7.室温放置2-5分钟，干燥核糖核酸；8.加入DEPC-H2O 30或40微升溶解核糖核酸，并储存在-80。核糖核酸浓度的标准化：吸收4微升核糖核酸和196微升DEPC水，稀释50倍，用分光光度计测量样品浓度。记下A260、Con(微克/毫升)和A260/A280。原始浓度为测量浓度*50(A260和Con转换为Con 3360，A260=40，A260/A280为1.6-2.

12、0，线性范围最佳)。标准化的方法是将最低浓度的样品标准化，标准化10微升的核糖核酸，计算加入到每个样品中的DEPC量，在逆转录过程中加入的核糖核酸量为X(0.5微克/原始浓度*1000微升)。逆转录聚合酶链反应材料：逆转录试剂盒(TAKARA DRR047A)、聚合酶链反应试剂盒(TAKARA DRR081A)聚合酶链反应水(无菌蒸馏水)、200微升去核糖核酸酶离心管、聚合酶链反应8连接管、定时器和水浴箱反转录反应系统是20ul(1)基因组脱氧核糖核酸去除反应。5克脱氧核糖核酸擦除缓冲液2ul克脱氧核糖核酸橡皮擦1微升不含核糖核酸酶的dH2O (10-2-1-X)ul总核糖核酸42水浴42分钟，4保存(2)逆转录反应。5*PrimeScript Buffer2 4ul引物逆转录酶混合物1 1微升室温底漆混合物4 1ulRNase自由d H2O 4ul378515分钟，持续5秒(聚合酶链反应，约16分钟，迅速转移至-20保存)聚合酶链反应系统是25ulSYBR预混EX Taq12.5 ul上游引物0.25微升0.25微升下游底漆聚合酶链反应水10微升c脱氧核糖核酸2ul*无论是进行逆转录还是聚合酶链反应，首先应根据样品数量计算每种试剂的量，将其混合在一个试管中，然后将其添加到每个反应试管中，然后从每个试管中添加核糖核酸或碳