高效液相色谱培训

1、HPLC的使用和维护，分析和制剂研究室的胡锋，基本原理和特征液质联用仪器零配件的实验操作和应用日常维护，基本原理和特征，基本原理：熔化在流动相中的各成分在通过固定相时，与固定相作用(吸附、分配、络离子吸引、排出阻力、亲和)的大小强弱不同，固定相中滞留时间不同特点：分离效率高，分析速度快，应用范围广，操作自动化。一些商品化设备、脱气设备、四元泵、检测器、柱温箱、样品盘、控制温箱、流动相、液质联用设备启动流程，HPLC系统各设备通电，泵、自动样品器、检测器通电，设备通过自检后， 打开计算机，启动电色谱管理软件，准备流动相过滤，脱气电色谱泵的排气用新调制的流动相注入泵进行高速液相色谱法装置的构成，输

2、液系统采样系统的测定系统数据记录处理系统，液相色谱仪的程序流程图， 液相色谱仪y的流动相，液体柱-保持值和pH的关系，pH变化值0.1，RS变化值1.6， 柱： zorb ax stable bond C18 4.6 * 250 mm 5um流动相： 27%甲醇： 73%磷酸pH: 2.52.6温度： 5.0流速： 1.0mL/min .2 .流动相别、流动相组成别：单成分和多成分极性别：极性、弱极性、无极性使用方式别：等度溶出和梯度对溶剂的要求水：脱络离子水自动纯水仪纯水商品瓶溶剂：电色谱纯水(甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、异丙醇)试剂3360分析纯水，无论采用哪种方法，都可以根据水流调制新鲜水，

3、水质要求越高放置时间越短。 理想的HPLC用水高纯水为18.2，通过0.22um的过滤烟嘴去除热源、有机物、无机络离子及空气等。 过滤：0.45um以下的细孔径过滤膜的目的：去除溶剂中的微粒，避免色谱柱堵塞，特别是使用无机盐制备的缓冲液。 脱气：流动相的溶解和混合对气泡气泡气泡去除测定的影响：1)使泵中的气泡流动变动，改变保持时间和峰面积；2 )柱中的气泡绕过流动相，峰变形；3 )检测器中的气泡产生基线变动，过滤和脱气，流动相的保存，有机溶剂流动相：1) 遮光保存缓冲盐流动相：当天配合：在低温下密封保存一般来说，防止微生物生长的有机溶剂和水(缓冲盐)混合的流动相：在低温密封保存下选择适合防止有

4、机相挥发的容器，1梯度溶出的特征，(1)改善分离，(2)加快分析速度，(2)改善尖形，减少拖尾， (3)有利于微量成分的检测；(4)增加峰容量；(4)强滞留成分难以残留在柱中，长期良好地保持柱的性能；(5)下次分析时，流动相需要一定程度的平衡时间，如果不同溶剂的UV吸收程度稍有不同，则有可能引起基线偏移，进行2梯度溶出坡度时间坡度曲线：线性、凸型、凹型等。梯度溶出、梯度：低压混合、低压梯度用单泵发生梯度，泵前(低压端)混合脱气要求高，梯度难以调整的迟滞现象体积，如设计错误，梯度的精准性影响迟滞现象体积(系统体积)设计合理，梯度迟滞现象：受系统体积的影响，迟滞现象体积进样器、阻尼器、 包含混料器

5、及其管路，梯度迟滞现象大小的影响迟滞现象体积过大引起的梯度变化的延迟，例如，迟滞现象体积为2.0ml，流速为1.0ml/min的实际梯度比设定值延迟2分钟进行响应，对微柱色谱分析法的影响不会增大， 在该例中，若流速为0.1ml/min的实际梯度比设定值延迟2.0量而不能接受响应的延迟体积的差异，则若方法转换的麻烦的延迟体积比文献大或小，则若方法不能再现延迟体积的变化，则梯度再现性差的普通的分析型液质联用的延迟体积为24ml， 延迟体积变化的影响是设计差的HPLC系统，延迟体积在反压下变化延迟体积在反压下变化结果：梯度精准性差，结果：方法的适应性不使用静态梯度混料器固定迟滞现象体积可以明显改善梯

6、度特性，液质联用柱、柱的连接， Stop_depth长度不当，柱前死体积不合适，锥腻子粉不合适，柱连接，柱上端固定相变色部分(约3mm左右)去除，补充新的固定相。 柱吸附不溶出的成分时，柱效果显着降低，选择适当的溶剂进行清洗。 采用梯度洗脱时，柱在反复使用之前，用泵将柱体积数倍的起始溶剂压在柱上，重新建立起始平衡再生。 提高列效应的方法、HPLC检测仪应提供的功能、样本，并且输出信号应提供给检测仪的响应值和样本浓度之间的线性关系的设计校准技术，促进了这种关系，理想的HPLC检测仪、灵敏的可忽略的基线噪声的宽线性范围， 流动和操作残奥仪表的响应对压力、温度和流速等的变化不敏感的长时间操作的稳定性

7、低的死体积非破坏性选择性，灵敏度： s/n比，灵敏度是信号和噪声的比，即峰值和基线噪声的比(s/n )检测限(LOD):S/N=24定量限(LOQ):S/N=810良好的信噪比有利：更好的电色谱峰确认更具定量电色谱峰纯度/均匀性，卡卡卡卡卡卡卡6目前实验室最受欢迎的遴选公司约75%的检测器是吸光率检测器(其中50%是多波长，25%是PDA )， 通过溶液后的紫外光或可见光的光强损失吸光率与样品浓度呈线性关系，这是在被测物的最大吸收波长下检测灵敏度最大、吸光率检测器(UV/Vis )的优点，这种检测器简单可靠，多数人熟知该技术并喜欢， 可以进行梯度实验，非破坏性很多有机化合物具有一定程度的吸光率

8、一般灵敏度较好，而吸光率检测器(UV/Vis )的缺点是并非所有化合物都具有吸光率，所以当通用检测器对某些化合物的检测灵敏度达不到其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长时， 必须使用多波长检测或权衡波长：截止波长以上510nm作为工作波长缓冲盐，络离子也会影响试剂、胺改性剂， 背景吸收对紫外检测器噪音的影响uvspectrumofeluentswith 0.1 % tfaagainsthplcgradeh2o空白，溶剂混合的基本线路噪声，电色谱条件栏： c18， 5m 3.9x150mm at 35 C .流动相： a :1 % tfainwater.b :1 % tfinaacetontr

9、ile .坡度：5- 4.0 % b in 3.5最小.流速： 1.0 ml /分钟.样品：水(10lqi.vol.)测定五个肽的5ng个样本，良好的电色谱系统容易识别所有峰值。 在坏的电色谱中，第一个峰值消失在基线的噪声。/基线噪声对积分的影响，维护流程图，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是，可以是， 孔径10um故障：堵塞表现：管路上持续有气泡的发生对策： 5稀硝酸，用医学超声清洗，用蒸馏水清洗，吸引过滤头，故障：宝石球或塑料瓦斯气体包脏密封不良表现：系统压力变动大的对策：打开排液阀， 将异丙醇作为流动相输

10、液取下止逆阀，放入异丙醇中，用医学超声清洗，止逆阀后发生故障：堵塞现象：系统压力变动大或压力高的措施： 5稀硝酸，超声清洗判断根据：关闭排液阀，切断出口管路，设定流速1mL/min，压力、管路过滤器、泵的保养：使用流动相必须尽量清洁输液处的砂芯过滤头，在更换流动相时必须防止沉淀，避免泵内堵塞和气泡，在每次分析结束时，重复清洗样品口， 样品的交叉污染必须防止，柱子的保养：柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲、强烈振动的柱子和库克吉卜赛人格拉夫接合时， 阀部件和管路必须进行漂亮地清洗注意流动相的脱气不要使用高黏性系数的溶剂作为流动相样品必须进行精制严格控制样品量每天的分析作业结束后， 清洗样品阀中残留的样品在每天的分析测定结束后，如果长时间没有使用用适当的溶剂清洗柱的分析柱，则使用适当的有机溶剂保存、封闭柱的柱内体积和平衡时间， 单次样品运转时间=分析时间柱平衡时间柱平衡时间=10倍柱内体积流速、柱清洗保存反相柱：用20%甲醇溶液清洗1.0柱体积，保存在90%甲醇溶液中。 分子筛柱：用