植物抗虫基因工程

1、植物抗虫基因工程,一、前言 虫害是造成农作物减产减收的主要原因之一。采用化学和生物农药等手段防治固然可以减轻害虫对农作物的危害,但这些方法不仅费用较高(每年耗费约10 亿美元) ,而且由于害虫产生抗性等原因,防治效果欠佳。全球每年因虫害对农业生产所造成的损失仍高达20 %30 %。长期大量地施用农药除了使害虫产生抗性外,还会带来一系列的社会问题,如人畜中毒事故的发生、食物中农药的残留以及环境污染等。 通过常规育种技术和试管培养技术虽然已获得某些抗虫害的作物品种。如野生型马铃薯( solanum chacoense ) 和栽培型马铃薯(s.tuberosum ) 的原生质体电融合获得的体细胞杂合

2、品系对一种马铃薯甲虫具有抗性。然而, 新品种的选育需要较长的时间, 并且某些虫害尚无基因资源作为杂交的亲本。所以, 用这种途径来获得抗虫作物是很困难的。,玉米田里的虫害,为害症状,粘虫 （又称行军虫或剃秆虫 ）,水稻田里的虫害,稻蓟马危害状 （受害叶叶尖枯黄，甚至枯死）,稻蓟马成虫,植物抗虫基因工程的研究之所以能取得如此迅猛的发展,主要是由于利用基因工程培育抗虫作物新品种或新品系具有以下几个明显的优点: 保护作用具有连续性,可控制植物整个生长期内害虫的危害; (2) 对整个植株都有保护作用,包括化学杀虫剂很难接触的叶下表面及根部等; (3)对害虫毒性具有专一性; (4) 可大大缩短育种周期,降

3、低成本; (5) 所表达出的杀虫蛋白存在于植物体内,不易被气候等环境因素破坏，不存在环境污染; (6)基因资源非常丰富 。目前全世界最常改良的性状中抗虫占第二位(24%)。,二、抗虫基因 人们已从微生物细菌中、植物本身以及昆虫体内发现并分离到许多抗虫基因，有许多抗虫转基因植物正在进行田间试验，并有一些品种已商品化。迄今发现并应用于提高植物抗虫性的基因主要有两类:一类是从微生物、细菌中分离出来的抗虫基因，如苏云金杆菌毒蛋白基因(bt基因)、异戊烯基转移酶基因(ipt)，另一类是从植物中分离出来的抗虫基因，如蛋白酶抑制剂基因(pi基因)、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等。其中bt基因和pi基因在

4、农业上利用最广。此外，昆虫特异性神经毒素基因等也在研究当中。,1 来源于微生物、细菌中的抗虫基因 1.1 b . t . 杀虫晶体蛋白基因 苏云金芽孢杆菌( bacillus thuringiensis) 是一种革蓝氏阳性土壤芽孢杆菌,在形成芽孢时,可产生杀死昆虫幼虫的蛋白质,即通常所说的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein) 或- 内毒素( - endotoxin) , 也称苏云金芽孢杆菌毒蛋白( b . t . toxic protein) 。它是目前世界上生产量最大的生物农药杀虫剂,广泛用于防治农业、林业等方面的害虫 。,b . t . 杀虫晶体蛋白是一

5、类分子量为130160kd 的蛋白质,在昆虫中肠碱性和还原性的环境下,被降解成6575 kd 的活性小肽,并和中肠纹缘膜上的受体结合。现已证明受体为氨肽酶n 和钙粘着蛋白(cadherin) 类似物。与受体结合的活性小肽插入到细胞膜上并形成穿孔,使细胞膜周质和中膜腔之间的离子平衡破坏,引起细胞肿胀甚至裂解,从而导致昆虫瘫痪或死亡。,bt抗虫棉,鳞翅目 鞘翅目 双翅目,近年来人们在t毒蛋白基因的修饰与改造、表达载体的构建、植物组织化等方面作了大量的工作。 尽管bt杀虫晶体蛋白的杀虫效果非常好，但其杀虫谱较窄，对其敏感的主要是鳞翅目和鞘翅目的一些害虫，如棉铃虫、玉米螟、马铃薯甲虫等。,1.2 其他

6、来源于微生物的抗虫基因 异戊烯基转移酶( ipt ) 是细胞分裂素合成中的关键酶,来源于agrobacterium tumefaciens (根瘤土壤杆菌)的ipt 基因在烟草、番茄中表达后,可减少烟草夜蛾对叶片的损伤,并降低桃蚜的生存力。然而, ipt 基因的表达对植物发育有负面影响,如使根系发育不完全,降低叶绿素含量等。,2 来源于高等植物的抗虫基因 2.1 蛋白酶抑制基因 蛋白酶抑制剂( proteinase inhibitor , pi) 是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一,是植物天然防御系统中的一部分,可抵抗食草动物的侵食. 其机理在于它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用,形成酶抑

7、制剂复合物,阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用,刺激消化酶的过量分泌,使昆虫产生厌食反应,导致非正常发育或死亡. 目前,至少有14 种蛋白酶抑制基因已转入作物中. 其中令人注目的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因cowpea trypsin inhibitor ,cpti),马铃薯蛋白抑制剂基因(potato proteinase inhibitor ,pi ),及水稻巯基蛋白酶抑制基因(oryzacystatin).,蛋白酶抑制基因在抗虫植物基因工程中之所以地位突出,是因为 不易产生耐受性问题; 抗虫谱广; 其来源于植物易为公众所接受,并已证明对人畜无副作用. 而且最近的研究资料表明,食用天然的植物蛋白酶

8、抑制剂具有抗肠癌的作用.,2.2 淀粉酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因分布也较广，以禾谷类作物和豆科植物种子中的含量最为丰富，在植物对病虫害侵染的天然防御系统中起着重要的作用(richardson，1997)。 这类酶抑制剂能抑制昆虫消化道内 淀粉酶活性，使食入的淀粉无法水解，阻断了昆虫主要能量来源；并刺激昆虫过量分泌消化酶，通过神经系统反馈产生厌食反应。,2.3 植物凝集素基因 植物凝集素是一类糖结合蛋白,也是植物防御系统的一个组成部分。第一个被描述具有抗虫作用的凝集素是菜豆凝集素( pha) ,它实际上是一种- 淀粉酶抑制剂。1993 年英国科学工作者从雪花莲中克隆出雪花莲凝集素基因( gn

9、a) ,对稻飞虱、叶蝉、蚜虫等有毒性作用。现在gna 基因已作为一种抗虫基因转化其他作物。我国黄大昉等(1997) 也报道来源于掌叶半夏和半夏的凝集素对麦管蚜、棉蚜、桃蚜等有致死作用。 目前成功用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有: 雪花莲凝集素( gna) 基因、豌豆凝集素( p -lec) 基因、麦胚凝集素( wga) 基因及半夏凝集素(pta) 基因。,雪花莲,2.4 来源于高等植物的其他抗虫基因 几丁质酶(chitinase) 是广泛存在于微生物和植物体内的一类蛋白,1989 年ary 等从job草中分离得到一种几丁质酶,发现它能抑制淀粉酶的活性,破坏昆虫肠上皮的保护层,导致消化道损伤.

10、 从而有效抑制蝗虫等昆虫类,但其在实际应用与理论相差较大.烟草阴离子过氧化物酶基因在烟草、番茄中表达时,可产生对鳞翅类,鞘翅类以及桃蚜的抗性,该酶作用是很复杂的,大部分人认为其作用不是直接的,而主要是其产物的影响. 此外,色氨酸脱羟酶( tryptophan decaiboxylase , tdc) ,核糖体灭活基因(ribosome inactive protein ,rip) . 豌豆脂肪氧化酶(pea lipoxygenase), 海藻糖酶抑制基因( trehalosfatin) ,番茄素( tomatime) ,多酚氧化酶( ppo) 和,脂氧化酶(lox) 都对昆虫有毒害作用.,3

11、昆虫特异性神经毒素基因 昆虫神经激素是已知三大昆虫激素的一种, 它控制着昆虫许多关键的生理过程, 影响昆虫的生长、变态、生殖、代谢和行为等, 近年来, 人们已开始在基因工程中利用昆虫神经激素防治害虫。目前, 蝎毒素和蜘蛛毒素两种昆虫特异性神经毒素已被用于植物抗虫基因工程。由于昆虫毒素专一作用于昆虫而对于哺乳动物无害或毒性很小, 因此可开发作为一种高效生物杀虫剂。,4 新杀虫基因的应用 传统抗虫基因主要是从人们熟知的具有杀虫能力的生物中克隆出来的,如从苏云金芽孢杆菌中克隆b . t . 杀虫晶体蛋白基因,而苏云金芽孢杆菌作为生物农药杀虫剂已在农业上应用了几十年。新抗虫基因除了继续从这类已知具有杀

12、虫能力的生物中克隆外(如营养杀虫蛋白基因) ,还采用了普遍筛选的方法,即用来作杀虫实验的样本可以是任意来源的植物组织、微生物发酵液以及商品化的蛋白质等。采用对农业生产危害较大,但又不好控制的害虫作为筛选实验对象。一旦出现杀虫效果明显的实验即进行跟踪鉴定,确定杀虫物质是否为蛋白质。如果是蛋白质,则根据此蛋白的功能、杀虫效率、杀虫的作用机理来判断其作为新一代杀虫蛋白的潜在价值。第二代抗虫基因中的胆固醇氧化酶基因就是以此方法发现并克隆的。,4.1 胆固醇氧化酶基因 胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的一个关键酶。胆固醇氧化酶的杀虫谱相当宽,对鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅目和同翅目的害虫都有不同程度的作用

13、。它能氧化害虫生物膜上的胆固醇,在较低浓度时,能使害虫的中肠纹缘膜受到破坏;在较高浓度时,能发生完全的溶胞现象,从而膜的结构和功能都发生变化以致引起害虫死亡,这一过程的生化机制目前还正在研究。 4.2 营养杀虫蛋白基因 营养杀虫蛋白是另一类高效杀虫蛋白质,它的敏感害虫是另一种对b. t . 毒蛋白不敏感的重要农业害虫鳞翅目的地老虎。 这类蛋白可能与敏感昆虫表皮细胞,尤其是柱状细胞相结合,造成细胞分解,伴随着肠道严重受损,受害昆虫迅速死亡。,三、抗虫基因工程的问题及展望 伴随抗虫基因工程进展，其在应用方面潜在的问题也日益显露。 1 抗虫转基因工程中昆虫的抗性问题 害虫的抗性是指一个种群在遗传基础

14、上降低了对某一种杀虫剂的敏感性。 目前较常采用的方法有： (1)使用组织特异性表达启动子和损伤诱导启动子等特殊的启动子； (2)采取2个或2个以上不同杀虫机理的抗虫基因同时转入植物中； (3)提供“避难所” 等。,2 “基因沉默”现象 无论是哪种来源的抗虫基因用于基因工程首要考虑的问题就是提高其表达量。一般来说，表达量越高，抗虫效果就越好。导入的抗虫基因翻译水平不高是普遍存在的问题，因此，如何提高外源抗虫基因在植物体内的表达，是植物抗虫基因工程的一个重要研究方向。,3 转抗虫基因植物潜在的生态风险性 转抗虫基因植物的安全性是一个长期、重要而且复杂的问题，应谨慎对待。抗虫转基因植物的直接生态效应是对靶标昆虫种群的控制，但靶标昆虫有无向其他寄主植物转移的可能；害虫天敌种群会受到怎样的影响；次要害虫是否会变为主要害虫；靠转基因作物的逃逸或从作物杂交中获取转基因抗性的植物是否会对自然植物群落产生严重影响都是需进一步研究的问题。为了防止选择基因或报告基因的潜在风险，目前，世界