科学·技术·社会　基因治疗 (2)

1、第八节 基因治疗与基因诊断,一、基因治疗的概念,基因治疗（gene therapy）就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。,Naked DNA,Target Cell,Therapeutic Protein,AAV,Retrovirus/Lentivirus,Adenovirus,Nucleus,Gene Therapy Principles,原位修复(基因修复）：对有缺陷的基因在原来位置上进行修复，使该基因恢复正常 基因替代疗法：治疗策略是切除发生缺陷的基因，再转入有功能的正常 基因增强：将目的基因导入靶细胞，目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的

2、功能 基因抑制：导入外源基因以抑制原有的基因，目的在于阻断有害基因的表达,二、基因治疗的策略,基因治疗的前景分析,基因治疗：降低成本 理论上所有治疗基因（包括非分泌蛋白）均可开展基因治疗 基因治疗：技术上难度大，有效性和安全性要求高 基因治疗：仅10余年历史，技术不够成熟，风险大,三、基因治疗的两大途径,1体细胞基因治疗：把外源基因导入患者的体细胞，以治疗或预防基因接纳者个人的疾病，只有特定的个体受益，但不能遗传给后代。 2种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组）能遗传给后代。 优点：目的基因转移到机

3、体的所有组织并遗传给后代。 目前尚未开展，一是涉及伦理学问题；二是技术困难（诊断困难、引起新的插入突变的危险）,又称间接体内基因转移，基本途径是： 个体供者组织或细胞移植物 组织培养 治疗基因或标记基因培养细胞 选择或富集转基因细胞 转染细胞实验动物或受试病人的靶器官,1.通过回体（ex vivo）基因转移的治疗途径,又称直接体内基因转移，将插入目的基因的表达载体直接导入体内的方法。基本途径是： 含治疗基因表达载体直接注射/与介质结合后直接注射或用基因枪导入体内 包装细胞系中包装好的复制缺陷型病毒颗粒 优点：简便省时省力，能很快观察到外源基因的表达及作用 缺点：DNA在体内不易进入细胞，易被降

4、解，以病毒颗粒的形式导入人体则易引起免疫反应和被补体灭活。,2. 通过体内（in vivo）基因转移的途径,四、基因转移的方法,病毒载体 逆转录病毒载体 腺病毒载体 单纯疱疹病毒载体 非生物学方法 直接注射 脂质体 受体介导,（一）基因治疗的病毒载体,应该具有的基本条件： 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 介导外源基因的转移和表达 对机体没有致病能力,充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因、包装容量等） 外源基因插入病毒基因组的非必须区 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（由辅助病毒或

5、宿主细胞提供该基因的功能）,病毒载体的产生,反转录病毒(Retrovirus, RV)载体,优点：基因转移的效率高，细胞宿主范围较广泛，DNA整合效率高于其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态的细胞，载体容量小（8kb），目的基因在未分化的细胞中常丢失，随机整合潜在致癌的危险。,优点： 安全，不整合到染色体上 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点： 免疫原性较强 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因表达持续时间有限 插入外源DNA的能力也有限（7kb）。,腺病毒(AV)载体,优点： 嗜神经组织 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点： 较大的基因组使得遗传操作较难进行 不整合到宿主细

6、胞基因组，表达持续的时间受限 包含大量功能基因，安全水平尚待进一步观察,疱疹病毒（HSV）载体,优点： 安全，痘病毒在人类历史上已经广泛应用 外源基因的容量可达30 kb 适用广泛的细胞型（可感染非分裂的细胞） 缺点： 不整合入细胞基因组，故外源基因表达的时间不能持久 载体过大，受免疫系统的影响也较大。,痘病毒（Poxvirus, PV）载体,（二）非病毒载体,1. 裸DNA 2. 脂质体/DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法,1. 裸DNA,方法：直接注射或基因枪轰击 溶液类型对基因表达有影响： 重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS,2. 脂

7、质体/DNA复合物,形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被细胞内吞。,无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求,人工脂质体膜具有如下特点,阳离子多聚体 DNA带负电 细胞表面带负电,3. 多聚物/DNA复合物,受体介导基因转移技术 磷酸钙共沉淀法 电穿孔法 显微注射法,4.其它方法,转入功能基因（单基因遗传病） 血友病B 薛京伦等用逆转录病毒载体将IX因子的cDNA至血友病B患者的皮肤成纤维细

8、胞中，再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表达明显增高，症状得到改善 重症综合性免疫缺乏症（SCID）,五、基因治疗的应用,重症综合性免疫缺乏症（SCID）,腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多，改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致免疫缺陷,1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到人体骨髓组织（患有腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID,基因治疗SCID的过程,转基因治疗的问题与危险性,有效的目的基因过少； 安全性:导入的基因缺乏调控手段； 有效性和稳定性：缺少高效和导向的载体系统； 目前人们多重视分子水平的

9、研究而忽略了整体研究，对整体宏观水平缺乏了解。,1999年9月17日，美国Arizona州18岁的青年格尔辛格在宾夕法尼亚大学人类基因治疗研究所接受基因治疗4天后不幸死亡，成为基因治疗实施以来第1个直接死于这种试验的病人。,生物技术与医药卫生,六、基因治疗关键问题,1.靶向性基因导入系统 基因治疗的关键问题是将治疗基因送入特定得靶细胞，并在该细胞中得到高效表达； 2.外源基因表达的可控性 导入基因后无调控表达将会产生严重后果。最理想的可控性是模拟人体内基因本身的调控形式； 3.治疗基因过少,Fig.1. Map of recombinant Ad.RGD.mda-7 and Ad.RGD.pK

10、7.mda-7 adenovirus vectors genomes encoding mda-7.,Fig.2. Figure showing the enhanced tumor killing effect of genetically modified Ad.RGD.pK7. mda-7 and Ad.RGD.mda-7 viruses compared to unmodified Ad.mda-7.,Fig.3. PBS (A) or control virus Ad.GFP treated animals (B), or Ad.RGD.Pk7.GFP treated animals

11、,Fig. 4. Significant inhibition of tumor growth and bloody ascites was shown in Ad.mda-7 treated animals (C) and Ad.RGD.pK7.mda-7 treated animals(E).,基因治疗在未来人类重大疾病的预防和治疗上必将发挥越来越大的作用！,七、基因诊断（Gene Diagnosis）,G到T一个碱基的改变，决定了一个人的命运 小皓珩出生23个月就出现皮疹、便血等病状，患上了罕见的原发性免疫缺陷病。 DNA序列分析，证实了小皓珩WAS蛋白基因的1388位核苷酸由G突变为T

12、，使编码谷氨酸的密码GAG突变为终止密码TAG WAS蛋白突变为无功能的WAS蛋白，导致患儿血小板减少，淋巴细胞形态和功能异常 希望：WAS目前已经可以用骨髓移植或干细胞移植根治,通过从患者体内提取样本(DNA)用基因检测方法来判断患者是否有基因异常或携带病原微生物的方法，就是基因诊断。,生物技术与医药卫生,传统与基因诊断的比较,传统的诊断 望 问 听 触经验 化验/检验微生物、免疫学、生物化学、病理学等对细胞、组织、酶、代谢物等检测 影像学X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等 特殊检查肌电/脑电/心电、骨密度等,基因诊断 应用分子生物学方法：如PCR技术或PCR与分子杂交标记 主要应用于 先

13、天遗传性疾患（苯丙酮尿症、血红蛋白病） 后天基因突变引起的疾病（肿瘤、糖尿病） 病原生物的侵入（流感、肝炎、艾滋病） 个体识别、法医物证,生物技术与医药卫生,感染性疾病检测,利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 结核杆菌和疟原虫的分型,公安司法系统罪犯及受害人的身份识别及亲子鉴定 部队 伤亡士兵的身份识别；印尼海啸中死难人员身份识别 保安 个人DNA身份证，用于人员识别,个体识别,14岁智障少女怀孕 亲子鉴定牵出70岁嫌犯,作业：,“英国研究人员2007年4月12日宣布，他们在世界上首次确认了一个与肥胖相关的等位基因，他们将之称为FTO。这一研究成果发表在科学杂志上。”如果你是