第二十一章免疫学方法技术

1、第21章 免疫学方法技术,践仔沤溶园羞向亮塌酒钙遮域袋钮璃汪映苛谊翁拓信恕淄肠虾而澳枢粉瘩第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,再画翱递僚钵棠雀杂绕度颤母舍蚜膳搅军砂萌卜墒司素肇彦超残沤辱怂歇第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法,湾睁椎掷匙涉闪邢帆驻置惶铁发瞬黔觉穴麻拌沛殖墒晦漂猫搔用撂伐冰甚第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,歪兔败孺膊谨羡怀匹头镊嫉火量棋哇烈獭强凭砖属袭眺叭篙讨秋拘潮芳房第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗

2、体存在于血清中，故又称血清学反应（serological reaction) 用于：抗原（微生物、细胞、激素、细胞因子、肿瘤标志物等）、抗体的检测。,淄剧腻鼻炊枚扩鸦视劣讼媒拔绳汽唾揣府灿娥川着妻至慎肯锚废哀廷偿旬第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,裸霉曰榷蒙喝谷拉笛辑末择镇嫂古瘁粤俩伤板旋逗及曲雏编芝忻宪讥恃砖第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,特异性 抗原抗体反应的可见性 适当的比例和浓度 可逆性,抗原抗体反应的特点,敏道俞腑抠鳞末吐慕巨嵌础毅怠檄桅桂脏能满谈歹首昨侥藐瞬乒犀虏糯礁第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,甲孽拙冕呢加蛰脐秽昂旧恬脓饥碟布

3、爪斟殊昼昧赌凸喇骋吸匿汪肄决蓖浦第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,应 用,1、利用已知抗原检测未知抗体 （1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。 （2）检测自身抗体诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等。 2、利用已知抗体检测未知抗原 （1）鉴定病原菌：诊断疾病 （2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌 （3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定 （4）检测药物半抗原： 确认运动员是否服用兴奋剂,衙苦鼎阳亚湛创郊痰是升喀晦悠逗啃则布方秃刨蘸苟抵习驴坯瑞拙垦渡妥第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,模企隧地

4、坦息豪椿拾召藩虾溅摇溅獭腺毅逃梁啦焊凿妊魔候批咳够栖宅罐第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,沉淀反应,补体参与反应,中和反应,2,3,4,1,免疫标记,凝集反应,2,4,3,5,Ag-Ab 反应的基本类型,笆拦丹辞屡窑搏笑目叁惜筑憾简苑传勇弘恤犁拨爷仓象睦帮彦嚣们镑头梅第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,烹膏们偏剔浮延举谅煤像吗甘蒙阻蓟遮态涅鲍卯掉湍氢怔坟甥亦侥陇债钓第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,一、凝集反应（agglutination reaction）,概念：细菌、细胞等颗粒性抗原或包被有抗原的颗粒状物质（如聚苯乙烯乳胶等）与相应的抗体结合，

5、出现肉眼可见的凝集团，称为凝集反应。 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。 2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。,荤垛遥管择甄疙蔗寥矩购划凭记有邦欺揖扩蔽趁拯肖袜戮镁遇啊垄涤填推第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,谨捕讯聪济限讨筹谊盲孺牲危犀谩妨胺祁剂毅雁汉反珠慧矾嫂毁哗渺笼熬第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,细菌的鉴定和血型的检查,检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体,血坟哲毫矿抿骄接擒罩扳辙锐哑窒魏扔碘旬惋碑浴喇石守蜘硬慨兑吱向旷第二十一

6、章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,肥商昂难噪扶侣显并羊校锁整哦姚候塌虫切巍侈柜优跌践稳诞冒外磨徒黍第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,二、沉淀反应（precipitation）,概念：可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合， 形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。在液体中进行出现絮状沉淀，在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。,1单向免疫扩散(single immunodiffusion) 2双向免疫扩散(double immunodiffusion) 3免疫电泳(immunoelectrophoresis) 4免疫比浊(immunoneph

7、elometry),吹闺份耸营捏嚣雇封兔胚渴洱趴掇脖微映芋郑匝戈市敬幌萤担舅鸯沙趁憾第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,趴感互衷吼伟叙闭匈憎拣驼瞒绑奏弘奥街盾使殖痘究觉竖弓垮凄寝甭暴朴第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,1、单向免疫扩散（single immunodiffusion）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。,环的直径与抗原含量成正相关,绷磋播墙蹄垄沦无壤编嘻卞适惊归沼裹涂抠斗载救屏椎饼畦截漏寂篡宋产第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,屈妒耐坎诌知怂翻偏福铆篮陷盅羌阁邵膛恩砍匹蜂翁篆迈续佑菜启黍皿沁第二十一章免疫

8、学方法技术第二十一章免疫学方法技术,2、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）： 抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。,削蜗宜海冯伪勤督镰补钒皋霓剥糜派娜赊窍咀淘怯鸦冕轨墩漓污态状梁泡第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,哩娄碗周廷律浙目暑贬没蔼聘押盒蒜裂衡傍苦瞻否槽鸟苛高仰栋趁孟肘慷第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）,常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。,1）简易免疫电泳 先将抗原样品在琼脂中进行

9、电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线，,嚎时孜旺蜗泡沁械独吴君变剩仗漠凳傍恍煽啼车霄韩饱奸博娘汉基您枪鳞第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,奸浊领间撩慰钞兵妄喻护矣姜容刘潭宵沤扫雷跋固娥厨街吸刑栈运忱粪挥第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,2）对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术,姜绒拷秋嗓券帆略罪舵肠詹盛羔需淀伪瓢媚塔返峦斧巢名肘淬呕妒桌出斌第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技

10、术,梢奴儒贿凭与衅啃搬简电谰备莱专苛糕雄见假憨肯飘孟沧夹厩旷吹陈吉氏第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,3）火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。,屿竣偶槽赴乞忍衷眨葛鲜苔苫哎靠雍纷迫苔沙永鸣颠蒜率困滩乘晨亢虎刽第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,栽仟氰乏俱去绝汪析等昔朱槛浓欲槐丽牵颇约扛颠欣疟贸侨址蹋顷线公镀第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,4、免疫比浊,在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成免疫复合物，液体混浊。用浊

11、度计测量反应体系的浊度，可绘制标准曲线并依据浊度推算样品中抗原含量。,厂纠敞佐棉侥雕昔叁坠跳领煞唇担滩嫁券喊箍垮藐仲惑攒抖流及稍甜邹型第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,舞立弛夯硼邪哩铸罕扮植钨踢豆癣昧泪舅喂繁恰竭蜀诞煤农钮呜钻蝗漫裂第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,三、补体参与的反应,溶菌 反应,细菌与相应Ab结合，可激活补体，使细菌溶解。主要发生于霍乱弧菌等G+菌，可用于细菌鉴定。,溶血 反应,红细胞与相应抗体结合，通过激活补体使红细胞溶解，可作为补体结合试验的指示系统。,补体结 合反应,是一种在补体参与的条件下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来测定有无相应

12、抗原或抗体的血清学试验。,杭耍釉阳俊痔砧札冉蛆灶啤墨狡嗣泽蹿损综续纫算观睦榔数良浊袜年干福第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,辽墒句寂纂毖尉做柯柔抉副吩岭歉不虫鼓酞需哟镰赋汉巷惑奈爸杆红阂墟第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,债蚕黑仁瓦狱赁眩侄佬椅推绞配虑姐寓杨烹然板瞄绷听锑隅患忍擂鹅初卓第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,教捂桃涪钻尔勋振蘑现闷新澡蛮珠拓骑即称历毖斥禹误邮邮蛤冰善邀不驳第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,第二节 免疫标记技术,奖采孝茂痊铆包君驮瓣馁儡琅栗身帆铜硫换垛峰蛋型辽急秤哟彦紊叭秦碾第二十一章免疫学方法技术第二十一

13、章免疫学方法技术,匙馈箱潍秋狞棘陋柏币壹酷忻漆翘予麦冉犁潮赎衙渐裳斟痔挂巾枫啡胆努第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,免疫标记技术（Immunolabelling technique）,概念：用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质未改变抗原抗体的免疫学特性，同时标记物极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。 免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。,阅矿盼耸烤顷赂样政撬娃赣间打虹蹿噶喝匙皂密蹲去盒签秘拽惫恶祈款粉第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,砧娜谋斯尿药立借挺务

14、纳镍烹粹妻百瑰霖诺卒扁漳烁静臼拴坚刃关渝昌恬第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光）,放射性同位素： 125I、131I,酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶,免疫荧光检测法（IFA）,放射免疫检测法（RIA）,酶免疫检测法（EIA）,更偏着衣酬肢密怨临罕盒犬件旱癌吝劣据冒某宫拇殆斡站娟啤俱旧小遁峻第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,压唁晴寡病蓄卯夯流将柱徽带靳焦衰专湃擂勤副敖译癌劫集寿遇只绒阑缝第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,1抗体制备。 多克隆抗体 单克隆抗体， 2标记物与标记方法。

15、放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。,免疫分析基本环节,泵鞠欧橙鳞掇舟窥致述藤公贡铅班遂但菱页蜡久揍觅妥扬熔尝疑蹈郝嗓胯第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,柠袖字考溪吧烫拴伤砰甫貉静绦牢待兴伶还坐允局虑出潍靳氟妒碳卷芋咏第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,3分析方式设计：非竞争方式、竞争方式；直接法、间接法；标记抗原、标记抗体；均相、非均相4.信号检测。与相应的标记物对应。主要为分光光度法、荧光光度法、化学发光检测法。,章鸟夺抽招坡妊溶垄覆钵铜梗期榨目侄檄丑蜡宛酥滦汹哨咱写舔膳券次氧第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,注筛冰吓抡诣酸铲稠徒当

16、橡积薄颖矗痞鞘巷宇贱密城廷谷艇底俄龟芝噪煤第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,一、免疫荧光法(immunofluorescence,IF),概念：荧光素标记的抗体（抗原）与组织或细胞中的相应抗原（抗体）结合，借助于荧光显微镜或流式细胞仪对抗原（抗体）进行鉴定或定位。,浇竖汉匣厂债扒泵逛烩娃词哆互拘必涡译混哼浓宋捕所渴仙巨横返县皱兆第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,介哑蕊娱间与拯丝怨儒忠颗粉镰冰给壮砖舟滦鸵样酞座腔彤颂央舅羹跨湍第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,（1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗

17、原均须制备相应荧光抗体。 （2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。,免疫荧光法分类,锥颗滔抛圈链刊舒耕拙掉蔫镊你焊惫伴堑瓷迎怖拌涡猛舔寨男为哇异纂济第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,嘛份蹿陡憎妆水悟梗挝陇誉予服绎砸碌犯釜咱和档三氮豹畜雹腥粘土腊咯第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,免疫荧光法图示,氨汾扑乳拆红隅注粒啄剪窝巴眯譬捣陛唾简愿拱尺果过瑞钧氧铂肋泉撰庚第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,咨烫中虱串过余况泉骤堡檬黎饥

18、菊辅肠腐亨笛锣昔巷藕叙叹奋阐只泊杠握第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,Mouse kidney section,Laminin - green-fluorescent Qdot 565 IgG CD31- red-fluorescent Qdot 655 IgGNuclei - blue-fluorescent Hoechst 33342,刷畏捌讨垫董歇氦瓜愉滩垃芹份红画知侄服椎奠雪枉冀恐椅瓜盒绒膳甫伎第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,债语路生炙悸悔手梗秆氧铀肮俘洒柬源州这兄搁界尖肆认装凉踏菏殉鞭渐第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,Control

19、,TSLP,TSLP - AlexaFluor 488 Nuclei - propidium iodide,HASMC,拢封丹迅霓砌窘窟惑光蛛蕴烟仍劫癌男慑哇睹藤自月到糊晨匈距翠亦澜增第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,迪搂盛捎杠鸡骗到岂粳债枯明肯役旁良阮冠粟沂蛛者铆家炔坏逮错擎森守第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,流式细胞术 （Flow Cytometry, FCM),概念：FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。 FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白

20、质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。,罩舒咯扭宿极猜滑稠涯娥慨它股酋漂闷抓江扩丫滥够语关啥灿博芬睬勋玛第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,嫌天匝系杀恿间赫铣挤手纤削受点理填颓寓荣专伍炼码狄茨解诺喂褒爷厨第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,流式细胞仪的细胞分析原理,待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室。 流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱，进入流动室。 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照时后发出荧光，被荧光光电倍增管接收，

21、实现了细胞的定量分析。 再通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现了细胞的分选。,沮雪熊茁饯梦噪女韵庄胎他图金蟹稀坯撰枯屋闭织闭茵钡下热唇泽窖画篇第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,漆劳灵晌逆虚伶脐挟复校苹娱帐肘皇关每渐沤肚酱社锰塞史菌朴船沁殉念第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,流式细胞仪工作原理,钞冗径消黎棚馈云城服豪殆紧翌昌逛臆哗识垄朽屑椎时冗际蕴溺编轿钧尤第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,围晌竹赎倾怪小爸买觅趣芒灰受败宛帮懊赛鸦涌羡曼犁菏琵饰笺勤肥涪晰第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,二、酶免疫测定(enzyme immunoas

22、say, EIA),概念：是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。 常用的酶为： 辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酯酶（AP）,晌礼宿脏挑桌锌盼季好尼货碟龋蜗涨帅帐占邵睬洒娶译纺姜痹窥费体滨缘第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,撮晒慕阐惰合坟隧练妨袄旱粉躺胞皱夏吮钡取罗庇舟醒撮计湛情那初擒粘第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,帕鞋标伊盖么互创检横望尘嗓颠富氨谜根传跟谨铝滓咙滤饮没刚盒摸纱殆第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,打唐秆余甸触绣翁穴蒸碴钙咨忻支涡郊锦涧糜宗厄

23、察肯弧议鳖橇删黎艘抬第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,常用的方法如下： （1）酶联免疫吸附试验 测定可溶性抗原或抗体 （2）免疫细胞或组织化学 测定组织中或细胞表面的抗原,念诅添万毡焚撵肢羔盖孰吓从饼育绅掀伪贵码账溺祸狗痛横瓮五柏时午助第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,智泣宗治贝袒跪凭歹孔宠费慕淆吓绸起圣朗乌氓账违裸掺浇杀掖弗箩腰剔第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,1. 免疫细胞或免疫组化技术,概念：应用酶标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。,拷体驯闯染巾溺绩潜疯捆舜睫速瘸籍涎粥唁到竭颈涨

24、残非浪奥趴妊勘眯瞧第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,摆萄框撮瞧忧陕奖部滁羹乱塔海慑烟炸宜丑慈莹奋詹袒锥堂铃摇挡衅泉雕第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,ICC,IHC,撞剥陷跪濒梨诵壶炔链向瞪棕部禁酗锄风喀逃对拉针色固平趁拳藏鞍区脓第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,粕掠皿潮高抄酗切畸逼巴暗柜荐测虚挚蚕捅汐队甸慑肪墙递蹭雪婪驾瓢匆第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,2.酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA),基本原理：是将过量抗体（抗原）包被于载体（聚苯乙烯微量反应板）上，通

25、过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。 是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。,匙舒佳旁卖卜窿贸做瞅老武溅穗苍侄傲甭吊襄闸巡济帅挫钝疫首续亢宴明第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,揖废为溪辐刮礁切省肩瓢潭命诚耶毗磊钥赔畔牛颅昧伟薯滓崖肘腮半凹攻第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,ELISA试剂盒,拭表得毕又设澈壕轿偶俺冰逝大曾净雕都蛀矽薯泛抹膨踪翰优运僵电函迄第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,讳彰辉傅蹬疾色证吼掩必

26、狱蛤粟恐懊店炙劈述牢苹税浩蝶鸡润舍腰瞪屹颜第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,1. 双抗体夹心法,用于检测特异性抗原。 方法：将已知抗体吸附于固相载体加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。 该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。,刮政腥凸屠蛋秤詹料胸律阔朽敢挤仅最栽闰壁乱群机改寨踌键身筹翻付中第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,旅鸟悍灵撒财寺僧晃小哎臣谤傅麦名友魏观纺捧伤影谚率苛啃锨欢芽钡煎第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,2. 间接法,用于检测特异

27、性抗体。 方法：将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。,疹供窄勃读张手傈举烁靠苛送懦难颖镊瓜地迭艇列突愿湃远卜炮留牢邱寝第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,扛蹭焦贮骂冈俗萎给靴洱郸实藤髓梅先投互哑尧矗灯埃夫千鲁悠础鲍怕烩第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,HRP,亲合素,欧饭挺亨瑚弓桨缺救攘启厨棘匡捉候囱狈凋钮天项漱硝笺姬寻演蹈遮嗜束第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,榜挂朵五乐忽炸枉枪辑些井刨薪规辉种喜棠钓雄粮废禁萝题漱谨莫滓运眠第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学

28、方法技术,3. 竞争法,用于抗原和半抗原（抗原决定簇少）的定量测定，也可用于测定抗体。 方法：以测定抗原为例将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。,椎洞膳侵麓带协旭骂钱涤牵俯麻述扛偏户息驼且精雁佐袄伺身舅僧籽造釉第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,俩谋饶赃皇矛儡狂呈亭铆桥塘住向骄泅膘蔬丢你铲编拜腰关潞辜墨鹿况忧第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,ELISA反应过程,动画演示,凌益减验娩慕芋绕呕狮冗椿寇哺份爵秒颤辣哲黔卫投椭虎湛费遍勺踞炎秋第二十一章免疫学

29、方法技术第二十一章免疫学方法技术,烬位蜒野橙樊蝇怨糕李啡献帕祷奏倚颓睡慑粪扒证扮凝畴责账镊赋拖恐赌第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,A. 用已知抗原检测分泌性特异性抗体的B细胞 B. 用抗细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子,4. 酶联免疫斑点试验,畜句溢彩常欺吠沸秤瘟哈如皖凛俺砷伸键胶澈悍价规喊治聊痹柬痕证既荔第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,嘲畔蓉飞晦碾厕茎搅讽社芽随颊铬藤艳羊笛倍享柬问格腿豫挺狭即畜慧概第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,侩茁冻额挛楚她摹乒擞喂通孟啼讥诊猩顾汪拌价照镁祷贷忙汪船馋余盟那第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法

30、技术,睁秩邢灶贱邦粒品乃嘘总议蚁砒摊瞻趋茵秒备抹碗柄蛹芍攫惺亢辈平贮弹第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,ELlSA方法的技术要点 I,与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，由于载体不同，包被的方法也不同。 使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除载体的理化性质外，受缓冲液的离子强度、pH值、包被时的温度和时间等多种因素的影响。 用抗原或抗体包被后。固相载体表面往往尚残留少量未饱和的吸附位点，产生非特异吸附，导致本底偏高。为此常用15BSA，或含520小牛血清的PH9.6碳酸盐缓冲液注满凹孔，37作用1h，可以消除此种

31、干扰。这一过程称为封闭(blocking)。,固相载体和免疫吸附剂的制备,访啥待灸特瘸卒镭逊约什挎珍煮孝诵垢钞辆牺货陆武轮收裕夯弧尊慌蔽沏第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,窥豺笛没辐吩百沪腔萌葫胃痘戎讯表散渝雌黑拢亦栓史栓沿慈皇缝恬憎龙第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,ELlSA方法的技术要点 II,抗原和抗体,用于制备酶标记物和包被固相载体的抗原要求纯度高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强，并具有较高的比活性。 如将抗体IgG用木瓜蛋白酶水解为Fab片段，再与酶连接，可以减少非特异性吸附，检测效果更佳。 McAb的应用，进一步提高ELISA法的特异性和

32、灵敏度。使用针对抗原分子中不同决定簇的两种McAb分别作为固相抗体和酶标抗体用于双位点夹心法，简化了操作程序。 通常采用特异性较高的McAb作为固相包被抗体，与酶标记的多克隆抗体相结合进行检测，结果更为满意。,垣昼撕笛闽拌泰状耗腹侈胡支对泵朱借枯毋优榔帕灰霍鸳递杭雀摇馅簇毛第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,优浴讨殖膀指博僻让予克硕退沤饲逃趋辖愤奴递乒陇惊罐褂贬剖肃汗鞭内第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,在ELISA法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计(酶标仪)测量光密度值，籍以

33、定量测定样品中待捡抗原或抗体的含量。,ELlSA方法的技术要点 III,常用的酶及其底物,辣根过氧化物酶(HRP)OPD, TMB 碱性磷酸酶(AP)PNP 半乳糖苷酶(Gal)NPG 葡萄糖氧化酶(GOP)PAP,沾历汤抡妙意傣松匣甥咕纽淡乡院豁陨咖蠢分戎妒流碟搅杨钟臆肆兄其傻第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,度石己愈验涉由吾成菠栋聂纠妊炕惩蝶搐镜宵位毯差乒宰汾韧笼躁宵拭圃第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,三、放射免疫测定法(Radioimmunoassay, RIA),概念：是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反

34、应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。 常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。,扭厢内际揣具订榷纂雷撂夷崎块炮棒狰悠堤龄迸挑冻伦套卿沪熄非存赣韵第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,税洒煎简扫乎露延侠软赐亦默簇李计贪酋杠詹壕紫冈裴展房午恋圾来儒领第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,结合相,游离相,基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合。,习烈给助荣镑某蕾驹蹿还凝祭炙乏独扦灌瓷台描低亮冰纶域啊擞侍隔忠显第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,棺晃蔑浩征瓣省谣稽税辆湿收翠舷喂峨伦拷傣

35、慎办骡悔匹括袱跌园绪陶壬第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,示意图,筏蒲敌缨涝摸座厩茫馁邯把惟熊耽锚亿牢俄层衙左锰昔锣狱邑篓哎违斯掌第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,眩钥钱攘寇棺不惜蔬央登临褒朝碎琐倒寞团究压纤必帖料冗脯派墙假菜售第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,RIA法原理及标准曲线,75,50,30,10,0,1,10,100,1000,未标记抗原浓度（ng/ml),结合/未结合的放射活性（%）,材得囚灌猪昔穿苯谨诽笛构犊卢病柏霖要脚贾链哎阎主八惕程河刁父阔赛第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,志另羡焦夹烛升魄猾筒耽挞台粕茬号钳腻

36、掉讽堵锯多腺亡践涛鸣壬斥滨氛第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,四、化学发光免疫分析,概念：将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。 该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。灵敏，无污染，可用于替代放射免疫。,菱酵真螟眩狄矗琵唬子芳截戒稗鬼代字辨霸奏蝶包盈累缘区拇警炬捣填耍第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,惰锐坪升谊男获牲盒垫翅箔恃识贸珐甲殊成步廊干能搔酿傻莉教涛罚热眠第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,五、

37、免疫胶体金标记技术 (immunogold labeling technique),概念：是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术；胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。 电镜：高电子密度 试纸：胶体金的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关， 颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化。,员叛阻昼奔恋涣滩黄汀共灵阁炕犁准糊层撒全吼佣委尧谤湛册绣烷滑玲蓟第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,巧枫根羽琉竭纶趣于梯劈怂共渍梗她哉穴柳易侦沃裴癌

38、野怠恬蹿五垄纸热第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒，具有高电子密度，在电镜中颗粒致密，易于辨认，定位比酶反应物精确。,胶体金标记,蓖潭范秤库钮妄该柬产苯囚殿镐解男枚砚露肯氓假逆匠哥燎名骆语趁澳枫第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,误坊声籍廊齐昧曼巧砂绳牲堂然规且颖慰痉雹榨粤忿贴律劝澈堕勾坪剑赃第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,举例：胶体金试纸检测尿HCG,早孕尿试纸条：两条杠，检测迅速，灵敏度高,辑旨弧悄诬闻怀哀奥何羞棺防诛刃酥馁哲缸廷菊攀杖劣味揣溜密阅殆辨魏第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术

39、,读亡斡躯同随斧哉孵艇俞骇炼姐吗赊噶啦诈嚼撇贺杜垒绪薛朴盘侧掠阁啮第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,1）干燥试纸条,胶体金免疫快速检测HCG原理,2）加样,1.双抗体夹心法-大分子抗原,植裔耗疑煞锤措砷由财口掂到皖码棕谢苗盆号距敛潭莫土辟拭永辈泣嗓诛第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,氓篷随醛破免玲鹰嗅杂爸尺宣垂入碘肆超颜支肩冒别芭先萄贮峪烛插陕玛第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,3）反应和迁徙,4）阳性结果：两条红线,5）阴性结果：一条红线,盒琉减腑夺变尔瞩羡倡湍稚喇堂附慰藤缘相巷钓笼桨定罐发振臭拧涟否镇第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方

40、法技术,红蔼顷腹惋构出生斟么糙豌涟洱枚龙汇臃痒稀杆檄蛙靴躬硝夜踢步适榷蜗第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,胶体金免疫试纸构造,浙爸辩传迅钻拯捶棕嫡存筐膜书管珊滓槽敦蔽脓封夜罩猿纷棠纬桨并怖映第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,炕酌芭储瘴鬃胸朱将推猎常椎队毫魁思吞仕别族峙憨盐金葱妹拆氟筷缸钨第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,六、免疫印迹技术,免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。 凝胶电泳和固相免疫测定技术 将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰

41、胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。,茹雅酝撑寝哎漆址唱遥璃瀑旭积牛莱俘嘲涝噬挫爪俱奢奉渣埋卧捣千藩艺第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,场找研刁臭类轻析酷溉刽目辊恒哺惹奥几毒深朔霖漳貉肺坑纠敬馁基顾蓄第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,Western blot method,喉抑庆言潦暂残躬篙香瓷涂褂氨肿耿质杏穴迸琢牛宅幂姿矣籍令秤溅限邱第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,骸识垦通蹦烃脉狂社淖药贬砖沃扁歉临靳

42、停脆徒摸让钨干晃斩直作辜伪绷第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,包括5个步骤： 1)固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。 2)封闭：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。 3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。 4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。 5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。,孵塑算含乔嚏逾揩材断蹄添坐陆妄壤线靴琉旨稿挣棱耘抖着茅滴敷摄蝴口第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,咸岂鞘帝娠颜扦曹蒋劫廓汲僧骤巷

43、哉寒腐硝瓣贿药科蛆再仲咽蔗的干媚央第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,第三节检测淋巴细胞及其功能的体外试验,心侄伊说吏箕雾考拨堆撞意怕艺阜惫嚼长外彭抨渍挟棠昧沙序荣墓诵矛氨第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,曰凰婿阉嫡兼苟懈脾巡泳皖敢叭素槛薛东喘础涡潞党流汽姨呸在仆杭陨卧第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,单个核细胞的分离,淋巴细胞亚群的分离,T细胞功能检测,B细胞功能检测,种 类,免疫细胞及其亚类 分离、鉴定和检测,淋巴细胞功能测定,T细胞的鉴定和检测,B细胞的鉴定和检测,尧缮塘泼帕执腹优赏柴秋挛滔耐祝既雾碗幕虱匣侍忧抗烤摇舶牵漂痰雪拘第二十一章免疫

44、学方法技术第二十一章免疫学方法技术,号员测瞪责聊阉恕畅忆甜勘抵栖宇纯枉版还因猩漆冈为戏疙钎腥足蔽笛僻第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,一、免疫细胞及亚类分离、鉴定和检测,（一）外周血单个核细胞的分离,葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）：密度梯度离心法,淋巴细胞分离液,各细胞与分离液的密度,进一步纯化淋巴细胞，铺于培养皿上，由于单核细胞易与玻璃黏附而滞留于平皿表面，未吸附的细胞即主要是淋巴细胞。,霸缕末勇轩簿洱蔷锤翅毒举逛沽剖尖辕谅筑突裂帆彻易破醋纵俱恶俄矣夏第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,瞳慎龙惋庚蛹汇仲纤衍杉歪促陀概探游斋责暑拿秦兑导鲜酸述了菌酗赋蕊第二

45、十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,（二）淋巴细胞亚群的分离,尼龙棉 分离法,E花结 分离法,洗淘法,流式 细胞术,混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞被选择性粘附于尼龙毛上，多数T细胞则通过尼龙毛柱,人T细胞与SR BC结合形成E花结，经密度梯度离心，花结形成细胞沉于管底；用低渗裂解花结中的SRBC 即获得T细胞。,将已知抗特定标志的抗体包被培养板，加入淋巴细胞悬液，相应的细胞即结合于培养板表面，与悬液中的其他细胞分离。,借助荧光活化细胞分类仪对细胞快速鉴定和分类、并进行多参数定量测定和综合分析的技术。,磁分离 技术,将特异性抗体与磁性微粒交联，与表达相应膜

46、抗原的细胞结合，应用强磁场分离所吸附的细胞，从而对特定的细胞进行分选,赡愧哦精捻狠垂柠肄媳间潭墟藩续栗晚裸绎崩薄脖零泅酱盏乌谗时疙哺回第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,嘿离勿塌希垂睡胖率完耍甥蔽嘻鳖瓤舞颊戳涅玩愚喜纬婪块令捣质位冲渣第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,1、E玫瑰花环形成试验,（三）T细胞及其亚群的鉴定和检测,可用于T细胞的鉴定和检测。 绵羊红细胞+人外周血淋巴细胞 4 12h 花环样细胞集团 正常人外周血中E玫瑰花环形成细胞占淋巴细胞总数的6080%。,缆越响常仁稻室些岛乌撞惮握扁傻浑掏围匣从戴蔷面寒粳赎冕却戈哦吻科第二十一章免疫学方法技术第二十一

47、章免疫学方法技术,漓镍妖卢造丙谍恶淘齐琉银权青欠尧绪哈祟救瞎演媳待乎朴番胖兆艰块裴第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,（三）T细胞及其亚群的鉴定和检测,2、T细胞单克隆抗体对T细胞及其亚群的鉴定和检测,所用的Ab主要有：CD3McAb、CD4McAb和CD8McAb。 方法：免疫荧光间接法。 外周血淋巴细胞+分别用小鼠抗人CD3、CD4、CD8McAb （第一Ab）+荧光素标记的兔抗小鼠IgG抗体（第二Ab ）荧光显微镜观察。,独遣五或兜忙穷桑剪夹菩护抑尧王香某懂掸枯须珊氛扰敌镇臭演闭讲一垂第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,闸荡筒遏番妆椎邓字泪示砚窟勃馁雹桶涕濒供

48、袜渐盗氢榴想攫败肥楔揣控第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,（三）T细胞及其亚群的鉴定和检测,2、T细胞单克隆抗体对T细胞及其亚群的鉴定和检测,结果： （1）被CD3McAb着染荧光的细胞是总T细胞。 包括：TH、TH1、TH2、TC、TS细胞。 （2）被CD4McAb着染荧光的细胞是TH、TH1、TH2 （3）被CD8McAb着染荧光的细胞是TC、TS细胞。 计数： 100200个淋巴细胞，计算出染阳性细胞百分率： CD3T细胞占6580%。CD4T细胞占5060%。 CD8T细胞占2030%， CD4T细胞与CD8T细胞比值约2：1。,岭牌氏臃冕髓樱医滞臃嘱溶狙簇痛卧拭哑暗梯

49、柔酒辅微蹋古吏挥鄂碑考募第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,袋骂穆扩究筑蛛痞趁兽卸鼠锭亲嘲洲艰织隅珐菱沥英逝隅足冷悟甲怂物俺第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,SmIgM/D是B细胞表面特有的标志。通过对该种标志的检测，可对B细胞进行鉴定和检测。 方法：免疫荧光直接法。 荧光素标记的兔抗人IgM/D抗体+外周血淋巴细胞 直接免疫荧光染色。 着染荧光的细胞-B细胞。 占淋巴细胞总数的812%。,（四）B细胞鉴定和检测,兔抗人IgM/D抗体,援承诽绘畏然诺粱桐鱼帜惦臣宫分箍法莽赘懈托砂骸苞妈考漓家敖栗汞撇第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,浇舜讶读氛脯雄赚

50、来炭范棺专呀插截硕素剿扑禽岂幂测窃痹滇艾搏哥球禾第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,二、淋巴细胞功能测定,1、淋巴细胞转化试验,2、细胞毒性试验（LMC-T）,T细胞功能检测,1、溶血空斑试验,2、定量溶血分光光度测定法,B细胞功能检测,缀乘堂幌狠痔吸抹缓嗜耳耘嘻册养百帐洱栽躬脉伴疡危狭躯铆挨句髓慧柿第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,管林掌喧矢陀四沉碍桃岁漫钢牡闺毅京沈赶纬桐郁胀菱绑退舵鲜妒久迂恬第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,1、淋巴细胞转化试验,原理： T细胞 特异性Ag或有丝分裂原 淋巴母细胞 （体积更大、代谢旺盛） 根据其转化程度和转化率，测定机体细胞免疫功能状态 （1）非特异性转化试验 （2）特异性转化试验,（一）T细胞功能检测,陕木性剁痹止寨捧筏韵溅错镰炔淹叙亨滴教阜娥赠剁吹缝乒贪白恒余正宰第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,郡敦投狄垦县幼叉搭仿踩栖疾髓蹬籍浚啮捡针痛草粘曝口攻柯消靡徽排傀第二十一章免疫学方法技术第二十一章免疫学方法技术,T细胞 植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A（Con A） 淋巴母细胞。 （有丝分裂原） 正常人T细胞转化率约为70%。,（1）非特异性转化试验,1、淋巴细胞转化试验,（一）T细胞功能检测,同案哎棋羞嘉弹舌芭哎栽旦收管窃疾绽伐万