组织培养技术

1、细胞培养技术,Cell culture,2,细胞培养设备,3,一、基本概念,外培体养 in vitro 细胞培养 Cell culture 组织培养 Tissue culture 器官培养 Organ culture,4,细胞培养 Cell Culture 细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分

2、析中使用最为广泛。,5,组织培养 tissue culture 是从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 使用组织块（0.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养 Organ Culture 应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。 使用器官原基或器官的一部分或整个器宫,6,体外培养种类,7,细胞系cell line 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。 细胞株cell strain 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标

3、志，并能稳定保持这些特性的培养物。,8,原代培养 primary culture 从体内取出组织或细胞的第一次培养。 传代培养 passage 将细胞从一个培养器皿中转移或移植到另一个培养器皿中。,9,细胞周期cell cycle DNA复制、细胞增殖过程。细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂终止所经历的时相过程，细胞生长的过程有分裂期和分裂间期组成。,The four successive phases of a standard eucaryotic cell cycle,10,二、培养细胞的特性,培养细胞的生长方式： 贴壁生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长：

4、于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物的表面。见于各种造血系统的肿瘤细胞。,11,培养细胞的生长特点：,贴附性 贴附并伸展是多数体外培养细胞的基本生长特点。虽然 血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长，但是大多数的哺乳动物细胞在体外和体内均附着于一定的底物而生长。 接触抑制及密度依赖性 贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合、相互接触后便停止了分裂增殖，不再进入S期，也不会出现交叉重叠生长。,12,细胞系的生长过程（三个阶段）,原代培养或初代培养期 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养（1-4周） 传代期 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开

5、接种至两个或者更多的培养皿中（数天到一周左右） 衰退期 在此期间细胞开始是虽仍然存活，但生殖已经很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰亡、死亡（传代30-50次以后）,13,每代细胞的生长过程,滞留期：包括游离期及潜伏期 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮态，也称为悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10min-4h 潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。6-24h 指数生长期（对数期）： 此期间细胞增殖旺盛，成倍生长，活力最佳，最适合进行实验研究。3-5天 生长停滞期（平台期）： 此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。此时细胞虽已停止生长，但仍存

6、在代谢活动并可继续存活一定的时间。,14,三、细胞生存条件及代谢,15,无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。 细胞被置于体外培养后，失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累等，可导致细胞死亡。,基本条件,16,适宜温度 人体细胞的适宜温度为36.5+0.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力比对高温强。 温度不低于0时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用； 温度上升不超过39时，细胞代谢与温度成正比；把细胞放入25-35时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在4数小时后，再回到37培养，细胞仍能继续生长。

7、 对培养液中加一定量的保护剂（甘油或），冻存于液氮中，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞生物性状不受任何影响，成为保存细胞最主要的手段。,温度对细胞生长的影响,17,常用的低温保护剂是DMSO（二甲基亚砜），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,18,气体和pH值 O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。 开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般要把细胞置于95%的空气加5%CO2混合气体环境中

8、。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，主要作用在于能维持培养基的pH值。大多数细胞要求7.2-7.4。细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。,CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-,19,CO2影响培养基的作用在于： 为维持培养液的恒定pH值，最常用为加磷酸缓冲液的方法。其中的NaHCO3能供给CO2，但CO2易于逸出，故只适用于封闭式培养。常用Hanks平衡盐溶液中含有低浓度的NaHCO3，当打开含有Hanks液培养瓶时，则CO2迅速逸出而导致酚红指示剂变红，表明培养液变碱。细胞在碱性环境中时间过长可使细胞碱中毒；因此开放式培养时，需放在含有5%CO2的气体

9、环境中培养。也可用羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES，是一种非离子缓冲液，它对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要防止pH值的迅速变动，其最大的优点是在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。 大多是培养基中含有酚红作为PH指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。 培养基保存于4 C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。,20,人工培养基 按物质形态分为：液体及干粉培养基。 按来源分： 合成培养基 synthetic medium 根据已知细胞所需物质的种类和数量

10、严格配置而成的。是目前使用较多的培养基 细胞培养在合成培养基中，不能很好生长增殖；当加入5%血清时，大多数细胞不死和缓慢生长。一般需加10-20%的血清，细胞才能顺利增殖生长。 天然培养基 natural medium 加入一些天然成分如人或动物的血清、血浆和胎汁等. 无血清培养基,21,培养基中的营养物质 碳水化合物：主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖等，是细胞生长主要能量来源。 氨基酸、维生素 谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必须的氨基酸，细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供。在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20冰箱中保存，在使用前加入培养液内。各种培养

11、基中都有较大量的谷氨酰胺，但其培养液在4冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。 有文献报道：从 18例未经治疗的 APL病人外周血中提取APL 原代细胞, 在无 Gln 的 RPMI 1640培养液中补加 10% 胎牛血清,将细胞接种在 37 , 5% CO2 和饱和湿度下培养 4 d,计数活细胞, 并收集细胞行 Wri ght-Giemsa、 DNA、 POX、及NaF抑制试验、 墨汁吞噬试验和 NBT 还原试验等细胞化学染色, 于油镜下观察。 结果:经 4 d培养, 其活细胞密度为起始活细胞密度约为54%,而对照组为108%( P 0。01) ; 成熟分叶核粒细胞和杆状粒细胞比

12、例显著高于对照组( P 0。01)。 结论: 缺乏谷氨酰胺可使急性早幼粒细胞白血病原代细胞生长受到抑制，并可使之向成熟粒细胞方向分化。,22,促细胞生长因子 牛血清是提供生长因子和细胞所需物质的来源 无机盐 培养液中无机盐可帮助细胞维持渗透压平衡，细胞通常可耐受260-320 mOsm/Kg 。,23,血清 细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清。 血清的质量、种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同。使用前一定要进行检测。使用时应注意： 需要长期保存的血清必须储存于-20至-70低温冰箱中，4冰箱中保存时间切勿超过1个月。 瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20至-70低温冰箱中的血清放入4冰箱中溶解一天。然后移入室温，带全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀，勿造成气泡，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20进入37解冻，容易造成蛋白质的凝集而出现