7.分子标记与遗传图谱.ppt

1、第七章 分子标记与遗传图谱,1. 基因作图 1.1 基因作图的目的 1.2 三种基因图 1.2.1 遗传或连锁图(genetic or linkage map) 1.2.2 物理或分子图谱(physical mapping) 2. 遗传作图标记 2.1 基因标记 2.2 DNA分子标记 2.2.1 限制性片断长度多态性(RFLP) 2.2.2 酶切扩增多态性序列(CAP) 2.2.3 随机扩增多态性DNA (RAPD) 2.2.4 扩增片段长度多态性标记(AFLP) 2.2.5 简单序列长度多态性(SSLP) 2.2.6 单核苷酸多态性(SNP) 2.2.7 序列标记位点(STS),3. 物理

2、图 3.1 限制性作图(restriction mapping) 3.2 基于克隆的基因作图(clone-based mapping) 3.3 荧光标记原位杂交(Fluorescent in Situ hybridization,FISH） 3.4 序列标签位点(sequence tagged site ,STS)作图 4.人类基因组计划 4.1 人类基因组计划的总目标和内容 4.2 基因组计划已取得的成就 4.3 基因组测序的新技术 4.3.1 脉冲场电泳(pulsed field electrophoresis) 4.3.2 大分子克隆技术 4.3.3 新的DNA测序技术 4.4 新的DN

3、A测序技术,1. 基因作图 1.1 基因作图的目的 基因作图是将基因分配到染色体的基因座上。 通过对很多基因和其它标记相对位置的作图，可能产生一个染色体图谱或整个基因组的图谱。 基因作图可帮助人们理解与开发生物性状的遗传性质，特别是通过遗传连锁将一种性状的遗传与另一种相联系，或者通过将表型差异与染色体结构的改变联系起来。,在人类中，这使生化机制不清楚的遗传疾病的基因在特定染色体或染色体带型中定位，并通过与标记相连锁追踪家谱。 对几种模式生物在国际范围内展开制作遗传和物理图谱的工作，最终目的是确定整个基因组顺序。 基因组作图、分析和测序的学科称为基因组学(genomics)。,1.2 三种基因图

4、 1.2.1 细胞遗传图 1.2.2 遗传（连锁）图 1.2.3 物理（分子）图,NEXT ITEM,1.2.1 细胞遗传图谱 是通过将可观察到的染色体重排和表型相联系起来而产生的。这一类图谱分辨率低，在少数物种中应用，如哺乳动物和果蝇。 简单基因组的细胞遗传作图用来确定它们物理性质差异的位置。,1.2.2 遗传或连锁图 (genetic or linkage map) 采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验和家系分析。 遗传图距单位为厘摩（cM），每单位厘摩定义为1%的交换率。,BACK,遗传图以绝对单位被标定，反映了通过重组或染色体片断化标记

5、分离的可能性，遗传作图依赖的原理是两个基因座出现在同一DNA片断的机会随它们之间的距离增加而减小。 遗传图谱分辨率在细胞遗传和物理作图之间。 另外，重组频率在各物种中并不一样，因此，遗传图谱在不同的物种中反映了不同的物理距离。,BACK,1.2.3 物理或分子图谱(physical mapping) 采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。以真实单位（碱基对、千碱基对、兆碱基对）标定。 物理作图有最精细的分辨率，是作图计划的最终目的。然而，由于高等真核生物基因组只有一小部分被表达，有些物理作图方法被用来鉴定转录的序列。 多态型分子标记，如限制性片断长度多态性和包

6、含小卫星DNA序列标记位点可以同时用于连锁分析中的遗传标记和作为核酸探针鉴定的物理克隆。 同时，原位杂交使物理克隆能精确分配到细胞遗传作图的染色体条带上。,2. 遗传作图标记 任何一类图谱都有可识别的标记，以便寻找目标的方位和彼此之间的位置。 遗传标记在遗传学建立和发展过程中有着举足轻重的作用，同时也是作物遗传育种的重要工具。 随着遗传学的发展，遗传标记的种类和数量也在不断增加，主要分为4种类型，即形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记。前三种标记都是以基因表达的结果（表现型）为基础，是对基因的间接反映；而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。,2.1 基因标记 2.2 DN

7、A分子标记 2.2.1 限制性片断长度多态性 2.2.2 酶切扩增多态性序列 2.2.3 随机扩增多态性DNA 2.2.4 AFLP标记 2.2.5 简单序列长度多态性 2.2.6 单核苷酸多态性 2.2.7 序列标记位点,2.1 基因标记 在经典遗传学中，研究一种性状的遗传必须要求同一性状至少有两种不同的存在形式或称表型。 每个相对性状如豌豆高与矮，都有一对不同的等位基因(allele)控制。 最初人们识别的指令表型的基因都是通过肉眼观察辨认的。 但很快遗传学家即意识到可见的表型性状数目十分有限，尤其是当多个基因影响同一性状时，遗传分析往往陷入困境。 为了使遗传图具有更强的综合性，必须发现大

8、量易于区分的、较为单一的性状，具有生化特征的表型具备上述要求。,BACK,2.2 DNA分子标记 基因标记是非常有用的标记，但并非理想标记。原因之一是，高等生物可用作标记的基因十分有限，许多性状都涉及多基因。 此外高等生物基因组存在大量的间隔区，用基因作为标记将在遗传图中留下大片的无标记片断。因而会产生不完整的遗传图，必须寻找其他更有效的标记。,分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列；从本质上说，是以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。 DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现，依其所用的分子生物学技术，大致可分为以Southern杂交技术为核心的分子标

9、记和以PCR技术为核心的分子标记。 另外，由于其中有些DNA标记和重复序列密切相关，有时将这种直接源于重复序列的标记单独出来，以突出其独特性。,理想的分子标记必须达到以下几个要求： 具有高的多态性； 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型； 能明确辨别等位基因； 遍布整个基因组； 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； 选择中性(即无基因多效性)； 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)； 开发成本和使用成本尽量低廉； 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。 但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。,2.2.1 限制性片断长度多态性

10、（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLPs） RFLP是迄今为止发现最早和应用最广泛的最具代表性的基于Southern杂交技术的分子标记。 其技术原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，因此，凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。,RFLP标记是指用限制性内切酶酶切不同个体基因组后，含同源序列的酶切后段在长度上的差异。 RFLP能用于在DNA水平上直接测定遗传变异。 限制性内切酶的位点可能存在于一个生态型

11、中，而在另一个生态型中不存在。 RFLP标记的缺点： 需要相对大量的基因组DNA，用于被不同的限制性内切酶的切割。 精确的RFLP图谱通常必须使用F3代个体的pool。,该标记技术是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后，用特异探针进行Southern杂交通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。 其中探针为单拷贝或低拷贝的DNA克隆(cDNA或基因组DNA)，一般选择单拷贝探针。它有如下特征：,处于染色体上的位置相对固定； 同一亲本及其子代相同位点上多态性片段特征不变； 同一凝胶电泳可显示不同多态性片段，具有共显性特点； RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响，即无

12、表型效应。,RFLP标记的优点： 无表型效应： RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。 在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰； RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制。,2.2.2 酶切扩增多态性序列 (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP) 相似于RFLP标记，具共显性的特点。是通过PCR及DNA Blot杂交的方法来检测限制性位点的多态性。 CAP标记是以PCR为基础的；而RFLP是以Southern杂交为基础的。 首先基因组

13、区域通过特异引物（要求有序列信息）进行PCR扩增。可将RFLP探针的两端测序，合成引物进行PCR扩增。 扩增产物往往无多态性，需用内切酶酶解产物，产生多态性。,CAP标记优点： 仅需少量的基因组DNA，一个单个的叶子就可提供足够的DNA用于CAP分子标记的分析。,2.2.3 随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphic DNAs，RAPD) RAPD即随机扩增多态性DNA，RAPD分析技术是采用随机核苷酸序列为引物，扩增基因组DNA的随机片段而获得的一种新的分子标记； 或者说是用一个(有时用两个)随机引物(一般810个碱基)非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶

14、电泳分开扩增片段。 它在基因组图谱构建、基因的快速定位、阐明物种亲缘关系、种群生物学、分子生态学等方面得到了广泛的应用。,RAPD技术的基本原理 模板DNA经92-94变性解链后，在足够低的温度下（35-37 ，一般低于40 ）于一种随机引物（一般为十个碱基）退火，如果两个退火位点足够近（约200-2000bp），且分别位于互补的两条DNA链，通过PCR便可扩增出DNA片段。 由于不同的物种或者品种等不同材料的基因组DNA可能插入、缺失或者在退火的位点发生碱基的改变，扩增产物的长度就有所不同，可用电泳检测DNA扩增片段长度的多态性。 分析DNA片段长度的多态性可以得到相应的DNA遗传、分类、进

15、化等信息。,RAPD技术的特点 不需DNA探针，设计引物也不需要知道序列信息； 用一个引物就可扩增出许多片段（一般一个引物可扩增612条片段，但对某些材料可能不能产生扩增产物），总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法； 技术简单，RAPD分析不涉Southern杂交、放射自显影或其它技术； 不像RFLP分析，RAPD分析只需少量DNA样品；,成本较低，因为随机引物可在公司买到，其价格不高； RAPD标记一般是显性遗传（极少数是共显性遗传的），这样对扩增产物的记录就可记为“有/无”，但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子； RAPD分析中存在的最大问题是重复性不太高，因为在PCR反应中条

16、件的变化会引起一些扩增产物的改变；但是，如果把条件标准化，还是可以获得重复结果的；,由于存在共迁移问题，在不同个体中出现相同分子量的带后，并不能保证这些个体拥有同一条（同源）的片段； 同时，在胶上看见的一条带也有可能包含了不同的扩增产物，因为所用的凝胶电泳类型只能分开不同大小的片段，而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。,BACK,RAPD技术的优越性在于： 技术简便； 不需要物种特异之引物； 花费相对较低； 多态性水平高； 对整个基因组进行巡查； 只需少量DNA样品。,BACK,2.2.4 AFLP标记 (Amplified Fragment Length Polymorphisms)

17、 扩增片段长度多态性(AFLP)，其特点是选择性扩增基因组DNA的双酶切片段。 它实际上是RFLPs与PCR相结合的产物，既有RFLPs的可靠性，也有RAPDs的灵敏性； 该标记系统通过少量的引物扩增产生了数量丰富的带型标记，并且分辨率高，是一种十分理想和有效的遗传标记。,AFLP的原理是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点。 限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。 选择特定的片段进行PCR扩增，由于在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头

18、”，用与接头互补的但3端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3端严格配对的片段才能得到扩增。,再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 该技术包括三个步骤： DNA被限制性内切酶切割，然后与AFLP聚核苷酸接头(adapter)连接； 利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.51g； 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。,利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到大量的片段。 由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带

19、，而在另一品种中可能无此谱带产生； 这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记； 所以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。,2.2.5 简单序列长度多态性 (Simple Sequence Length Polymorphisms,SSLP) 限制性片断长度或PCR产物长度因为小卫星或微卫星随机重复数量的变化形成的差异。 SSLP具有多等位性，有两种SSLP常用于作图： 小卫星序列：又称可变串联重复，其重复单位为数十个核苷酸。 微卫星序列： 或简单重复序列，其重复单位为1-6个核苷酸，由10-50个重复单位串联组成。,微卫星序列的应用比小卫星序列的应

20、用普遍的多，原因有二： 小卫星序列大多集中在染色体的端部；而微卫星序列在整个基因组中分布广密度高； 微卫星序列PCR分析：PCR扩增的DNA长度少于300bp时，反应既快速又精确。 微卫星序列的多态性信息量（PIC）一般大于0.75。 PIC可定义为某一标记在群体中出现多态性的频率。,2.2.6 单核苷酸多态性 （Single nucleotide polymorphism，SNPs） 单核苷酸多态性(SNPs)基因组中单个核苷酸的突变称为点突变。 某些群体在特定的单核苷酸位置只有2个或3个SNP，这些位点称为双等位或三等位。 在基因的编码顺序中，SNP大多位于密码子的摇摆位置，表现为沉默突变

21、而被大量保存下来。 大多数SNP必须采取测序或寡聚核苷酸杂交检测。 SNP在同一个体中常以纯合态存在，它在基因组中的数量极大，人群中几乎任何两个个体的基因组都有SNP。,2.2.7 序列标记位点 （Sequence-tagged sites, STS） 序列标记位点，是根据单拷贝DNA片段两端的序列设计一对特异引物扩增基因组DNA产生的一段长度为几百碱基对的特异序列，在基因组中往往只出现一次，从而能够界定基因组的特异位点。 用这些标记物来测试整个基因组，包含同一STS的两个或多个克隆必然相互覆盖。 最富信息和多态性的STS标记可能是扩增含有微卫星重复序列的DNA区域所得到的。,在人类基因组作图

22、中已用STS作为将遗传图谱与物理图谱整合的共同位标，这在基因组作图上具有非常重要的作用。 跨叠片段图谱(Contig Maps)，通常是以STS为标记的物理图谱。 其构建过程是：先用基因组DNA建立含重叠(Overlapping)克隆的基因组文库，然后通过重叠克隆间所共有的核苷酸序列将所有的克隆沿染色体排成连续的跨叠系列(Contigs)。,3. 物理图 由于遗传图分辨率有限，精确性较低，在进行大规模的DNA测序之前，对大多数真核生物的遗传图必须进行验证，并利用其他作图技术予以校正和补充。 这里我们要介绍另一种基因组作图，即直接检测DNA标记在染色体上的实际位置。 物理作图技术最有用的方法有以

23、下类：,3.1 限制性作图(restriction mapping) 它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。 3.2 基于克隆的基因作图(clone-based mapping) 根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(contig),绘制物理连锁图。 3.3 荧光标记原位杂交(Fluorescent in Situ hybridization,FISH) 将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。 3.4 序列标签位点(sequence tagged site ,STS)作图 通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因组的DNA区段中。,3.1 限制性作图 最简

24、单的构建限制图的方法是比较不同限制酶产生的DNA片段的大小。 首先用一种限制酶处理样品，经琼脂糖凝胶电泳分离，染色后可见大小确定的DNA片段。 然后用第二种限制酶处理，获得第二组片段。 最后用种酶处理，获得第三组片段。,收集所有上述资料进行对比组装，对于种酶切位点交替出现的区段，利用加减法即可确定酶切位点的相对位置。 在连续出现个或多个相同酶位点区段，其排列顺序可有多种选择，此时采用部分酶切的方法使该区段只发生一次酶切，然后计算产生片段的长度，选择其中正确的排序。 后者称为部分限制作图（partial restriction）。,3.2 基于克隆的基因作图 细菌质粒载体通常只适合克隆小分子DN

25、A，随着插入的DNA片段增大，质粒的稳定性下降，因此常规的质粒载体不适用于大分子DNA的克隆。 对噬菌体基因组进行改造，构建了可调控的克隆载体以及与质粒相结合的粘粒(cosmid)载体。这类载体所能克隆DNA片段的大小决定于噬菌体颗粒头部的容量，因为重组的载体DNA必须包装进噬菌体才能感染大肠杆菌。,噬菌体头部的大小是确定的，所以载体克隆的DNA片段有一上限。尽管有这一限制，一些较小的基因组，如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组主要是先构建粘粒文库，然后建立克隆重叠群完成测序。 粘粒载体克隆的DNA片段比质粒载体提高一个数量级，但对于高等生物基因组而言，仍然太小

26、，因此人们构建了一些大分子DNA的克隆载体，如酵母人工染色体(yeast artficial chromosomes,YAC)，细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes,BAC)，P1人工染色体(P1-dericed artificial chromosomes,PAC)等。,3.3 荧光标记原位杂交 (Fluorescent in Situ hybridization, FISH） 荧光原位杂交是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。 目前这项技术已经广泛应用于动植物基

27、因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。,FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。 由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交，从而将特定的基因在染色体上定位。 与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点,因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。,3.4 序列标签位点(STS)作图 目前用于构建最为详细的大基因组物理图的主流技术为STS绘图。

28、 STS是一小段长度在100到500bp的DNA序列，每个基因组仅一份拷贝，很易分辨。 当两个片段含有同一STS序列时，可以确认彼此重叠。 两个不同的STS出现在同一片段的机会取决于它们在基因组中的位置靠得多近。 如果它们彼此邻接，这两个STS总会同时出现在相同片段上。如果它们相距甚远，有时会在同一片段，有时则在不同片段。,要将一组STS作图定位，必须收集来自同一染色体或整个基因组随机断裂的DNA片段。不同DNA片段之间有各种可能重叠，可以覆盖整个作图区段。 依次采用单个STS挑出它们所在的DNA片段，根据它们彼此的重叠关系可以逐段绘制DNA物理图。 一般可用杂交但更多地是用PCR来分析STS

29、所在位置，这一程序已经机械化，可自动操作。,4. 人类基因组计划 4.1 人类基因组计划的总目标和内容 4.2 基因组计划已取得的成就 4.3 基因组测序的新技术 4.4 人类基因组计划的后续任务,4.1 人类基因组计划的总目标和内容 获得人类基因组序列将有助于人类认识许多遗传疾病及肿瘤等疾病的致病机制，为分子诊断、基因治疗等新方法提供理论依据；也有助于人们了解人的发育过程，从而有利于人类的健康；对人类基因组的了解也将有助于人们了解人类的发展、进化历史。 正是由于了解人类基因组具有这么多重大的意义，在1987年，美国国立卫生研究院（NH）和美国能源部（DOE）联合提出了一项能与“曼哈顿”原子弹

30、计划相提并论的宏伟计划，即人类基因组计划，并于1990年正式实施。包括中国在内的世界各国科学家都积极地参加到这项计划中。,人类基因组的长度为3109 bp，含有5.0104 1.0105个基因。 人类基因组计划的主要目标就是完成对人类基因组的3109 bp的全部序列的测定工作，阐明人体中全部的基因位置、功能、结构、表达调控方式及疾病突变的全部信息。 人类基因组计划包括下列主要内容： 建立人类基因组高分辨率的遗传图谱，或称连锁图，找出遗传标记在染色体上的对应位置。首先对人的基因组进行分组，再对各组进行标记，为每条染色体或更小的区域都找到一些特定的DNA序列作为标志。,完成全部人类染色体的各种物理图谱及选择某些模型生物DNA物理图谱。 利用一致的标记序列，对已克隆的基因组DNA进行排序。 克隆并测定人的基因组和模型生物的全部序列。 建立、储存和分析所有有关资料和数据的工作系统。 具体研究每一个基因的结构、功能、表达、调控等性质。 创造完成以上目标所必需的新技术新方法。,BACK,4.2 基因组计划取得的成就 人类基因组计划已经取得了多项突破性进展，比预计时间大大提前。比如： 由于多态性微卫星序列在连锁定