2-1凝胶电泳3.ppt

1、第二节基因操作的主要技术原理、凝胶电泳扩增原理分子杂交DNA测序生物芯片、1、凝胶电泳是分析重组DNA分子和蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是分子生物学研究方法的技术基础。琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳，1，基本原理，带负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依赖稳定介质(琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液，在电场中以恒定迁移率从阴极移动到阳极。核酸分子的大小、结构或形状的差异，根据电荷，可以通过电泳分离混合物的其他成分。DNA的迁移率决定因素，1 DNA分子的大小，双链DNA分子的迁移速度与碱基对数的共同对数成反比。2每阵地的浓度越低，相同的核酸分子移动得越快。3 DNA的

2、设想一般是同一个分子：超螺旋圆形直线切口环。4凝胶和电泳缓冲液中溴化B (EB)插入双链DNA，导致负电荷减少、刚性、长度增加。5如果使用的电压低，则DNA分段移动率与使用的电压成正比。六阵地党有两种类型：标准阵地党和低熔点阵地党；凝胶电泳的分辨率：凝胶的类型和密度相关的琼脂糖凝胶的分辨率在0.250Kb之间。聚丙烯的分辨率为11000bp，分离范围与% agarose，低聚糖4-6 0.02-0.4，不同类型的琼脂糖特性，agarose gel电子，D-半乳糖，3，6-脱水-L-半乳糖，琼脂糖凝胶的特征，(1)优点1 3。凝胶结构均匀，孔径大，可用于分离酶的复合物、核酸、病毒等分子物质。4.

3、透明度比较好，可以直接或干燥制成薄膜后染色。5.不吸收紫外线，可使用直接紫外线吸收法定量测定。6.具有热可逆性，(2)缺点1。机械强度不好，容易破碎，浓度太低，渡边杏。2.容易被细菌污染，不易保存，任用前准备。3.琼脂糖支持层的条带容易扩散，电泳后要立即固定染色。4.与PAGE相比，分钟自我作用少，频带少。分为上熔点的琼脂糖和低熔点(LMP)琼脂糖。(1)每个LMP阵地的熔点：6265融化后可保持液体状态37小时。在25中，液体状态的约10min回收DNA可以维持运作。将凝胶加热65到几分钟，然后在液体琼脂糖中加入过多的酚液提取DNA，通过离心机获取含有DNA分子的上清液，将DNA片段切成酶，

4、然后电泳。(2)琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1 TAE(TBE TPE)凝胶含量：根据检测到的DNA大小，DNA样品：1g，指示剂溴酚蓝电泳条件：大部分低压长期，小块高压短时间琼脂糖融化时，位置太高，渡边杏。2.在粘合剂和加成过程中，必须防止气泡的发生。Eb具有强大的致突变性，可能致癌。必须戴手套操作，严格注意保护。4.添加样品时，如果样品孔太深或穿透塑料孔壁，将渡边杏Tip头。否则，样品泄漏或DNA带不均匀。5.打开电源时，要确保凝胶的方向正确。6.电泳仪有电压显示，不一定通电，必须观察电极气泡的发生。阴极的气泡比正极多两倍，表明电泳开始了。7.溴化乙可以插入DNA分子的双链中，由紫外线插

5、入溴化乙的DNA是橙色荧光，因此溴化乙可以作为荧光指示剂，表示DNA含量和位置。3，聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺PAGE- electrophoresis，PAGE-，原理，聚丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺(Acrylamide，ACR)和交联剂N，N-;n；N四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethyl ethylenedia mine，TEMED)和催化过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，)，丙烯酰胺，N，N-叉二丙烯酰胺，原理，聚丙烯酰胺凝胶三维结构，聚丙烯酰胺凝胶电泳类型，1改性聚丙烯酰胺凝胶，用于分离或纯化单链DNA片段。变性DNA在这种凝胶

6、中的迁移率与碱基的组成和序列几乎无关。用途：放射性DNA探针的分离，DNA碱基序列反应等。2非改性聚丙烯凝胶用于双链DNA片段的分离纯化。注：迁移率受碱基赵寅成及序列的影响。用途：制备高纯度DNA片段。(3)聚丙烯酰胺凝胶中DNA的有效分离范围，注：N，N-甲基酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30。主页，图片。1夹层竖板电泳槽图1。导线连接器2。下坦克3。凹型橡胶盒4。示例窗模板5 .紧固螺钉6。上坦克7。冷凝系统，图解。2凝胶模具图1。示例窗模板2。长玻璃板3。在短玻璃板丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子洗涤剂12烷基磺酸钠(SDS)，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于分子量，与电荷和形状无关，也取决于分

7、子量。因此，可以使用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。3，聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酸酯凝胶电泳，页面缓冲：PAGE凝胶聚丙烯酰胺电泳：聚丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺(29:1)；TEMED(四甲基乙二胺，加速器)和硫酸铵(10，催化剂)。垂直板电动游泳装置，加型，样品移动方向，混合样品，带孔胶，按分子大小分离，电泳方向，电泳，小分子，大分子，夹在两块玻璃板中间的凝胶，电泳缓冲液，电泳缓冲液，添加到槽中的SDS处理样品，分子量小，分子量大，分子量大，电源1。有分子筛效果，分辨率高。2.样品不易扩散，用量少，灵敏度10-6g 3。化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基的稳定亲水基团4。凝胶没有电荷，消

8、除了电渗现象。5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6。分离超分子量的DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向周期性变化。第一脉冲电场方向与核酸的移动方向成45度角，下一脉冲的电场方向与核酸移动方向相反，变为45度角。，脉冲电场电泳图，整个电泳移动方向为两个电场和45o，在电泳过程中保持电压稳定。如果用传统方法准备DNA，电压会随着时间的推移而增加样品。准备DNA样本与现有方法不同。4、脉冲电场凝胶电泳(PFGE)、琼脂糖凝胶电泳添加的电场方向、电流大小和作用时间交替变化，因此DNA分子必须随时调整游动方向。与分子量较小的DNA分子相比，分子量较大的DNA分子需要更多的次数来改变构成和方向

9、，以便能游向新的方向，因此移动速度减慢，达到分离大分子量DNA分子的目的。pfge can resolve large DNA fragments，类型，垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field)现场翻转系统(field inversion)旋转粘合剂系统(rotating gel)2电压：固定脉冲时间可以增加电场强度，从而扩大可分离的最大段的范围，但是电场强度太大，会导致小块游泳混乱。3电场角：电场方向的角度总是1100-1200，研究表明900度非常有效。4温度：每个标准阵地的电泳基本上在室温下进行，PFGE通常在4下进行。高温DNA游泳速度更快。但是温度越高，小片的

10、游泳阻断和明显的条带就越宽。种类1)根据凝胶材料，分为：聚丙烯凝胶和琼脂糖凝胶电泳(一般琼脂糖和低熔点琼脂糖琼脂糖)2)根据电泳装置，分为：水平/琼脂糖凝胶。纵向/聚丙烯凝胶3)分离效果和分离范围两种方法比较。操作容易，2。用途琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的日常分析。聚丙烯凝胶常用于小分子核酸分析。3.凝胶电泳的一般程序凝胶点电泳染色是DNA电泳1。DNA分子种类1)观察线性DNA单链和双链，注意在ss-DNA电泳中，局部区域形成ds-DNA，移动距离不确定。2)循环DNA单链(例如M13mp)和双链(例如M13mp)，这种DNA分子在电泳过程中的移动距离受以下因素的影响：I .分子量的大小3

11、360移动距离与分子量的共同代数成反比。二.凝胶浓度：浓度越高，移动距离越短，低分子DNA浓度越低，移动距离越长，高分子量DNA，iii。适合于分离电压，电压越高，DNA片段移动率就越大，这是不同的。四。碱基配置和温度：不受影响，温度高会导致DNA带变形或链松脱。4)环状ds-DNA电泳：用于质粒DNA的初步鉴定5)线性ss-DNA电泳链分离凝胶：化学排序时用于单链分离。DNA双链是互补的，但组成不同，但仍然可分离(机制未知)，由电泳形成三条带：变性双链，两条单链。核酸测序凝胶(染料指示剂):为了避免局部区域的次结构，沸腾样品，电泳温度增加，凝胶中添加变性剂(尿素、甲醛、甲胺等)，RNA凝胶电

12、泳方法：其他RNA电泳方法基于使RNA分子变性的方法。这些方法需要RNA分子在点样本中不仅是一级结构，而且在整个电泳过程中保持一级结构。1.乙二醛/二甲基亚砜法原理：乙醛能与核酸、核苷酸和碱基发生反应，尤其是鸟苷形成稳定的附加环，防止GC碱基的互补作用。RNA 10mM羟甲基醛和50% DMSO混合50，1 h改性点电泳染色观察2。羟甲基汞法原理步骤：RNA 10mM毫米羟甲基醛点样品在含4毫米羟甲基醛的琼脂糖凝胶上进行电泳染色观察，3甲醛法步骤：RNA 2.2M米甲醛50%甲胺点样品2.2米甲醛琼脂糖蛋白质电泳方法：变性和非变性聚丙烯凝胶电泳。电子通常被称为SDS-page。差异：变性用途：变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化，酶反应(颜色变化)SDS-PAGE可直接用于蛋白质分子量、婴儿成分的测定。MRNA翻译产物，基因表达产物测定等。核酸片段的分离和回收1。方法用于DNA、RNA和蛋白质的回收。1)电洗脱法：利用电泳法，将凝胶中的特定核酸分子放入其他介质中。2)滤纸法核酸凝胶染色长波紫外线在分离台前切一口，滤纸(背面复盖透析细胞膜)电泳