酶工程制药课件

1、第六章,酶工程制药,一、酶工程（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,第一节 概 述,对酶的认识和研究历程,人们对酶的认识起源于生产实践，人类几千年前，都开始制作发酵及食品。 1833 年，Pagon Persoz 从麦芽中得到一种能水解淀粉的物质淀粉酶。 1878 年，Khne 将这类生物催化剂统称为Enzyme。 酶工程的名称出现于二十世纪二十年代初 1969 年人工合成牛胰核糖核酸酶。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的

2、主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。 1983 年，发现核酸的催化功能1989 获诺贝尔奖,一. 化学酶工程 固定化酶：运动受到限制 修饰酶：在体外用一定的化学方法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成的酶。 人工模拟酶：利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子。 二.生物酶工程 工程酶（克隆酶） 突变酶 设计新酶基因,三.酶工程的基本过程可以概括如下,四.生物工程各分支领域之间的关系如何？,酶工程主要包括内容,酶的大量生产和分离纯化及它们在细胞外的应用 酶的固定化技术和固定化酶反应器 基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修

3、饰酶的研究 酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研究 酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究 抗体酶、核酸酶的研究 模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究 有机介质中酶的反应,新颖酶的发现、研究和应用,二、酶的来源,1）直接从动植物获得，即从生物体中分离和提纯 不足：生产周期长，来源有限，还要受一些自然条件的限制。 2）化学合成方法 不足：一般只适用于短肽的生产，实际应用还需相当长的时间。,3）工业微生物发酵，即通过液体深层发酵或固态发酵，是工业上酶的主要来源。 其优点如下： 微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全 微生物繁殖快，生产周期短 微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过

4、适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的高产酶的菌株。,微生物细胞产生酶的分类（按生成条件） 结构酶：在细胞的生长过程中出于其自身需要而表达。 诱导酶：加入相应的诱导剂后才会表达，诱导剂一般是该酶所催化反应的底物或产物。 野生型微生物经过遗传改造后变为高产酶菌株的方法： 物理诱变育种 化学诱变育种 基因工程构建,1.优良菌种的条件 繁殖快、产酶量高、酶的性质符合使用要求，而且最好能产生分泌到胞外的酶，产生的酶容易分离纯化。 菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易受噬菌体的感染侵袭 易于培养，能够利用廉价的原料进行酶的生产，并且发酵周期短。 菌种不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，不产生有毒

5、物质和其他生理活性物质。 不产或尽量少产蛋白酶。,三、酶的生产菌,2.生产菌的来源,a、菌种保藏机构和有关研究部门获得； b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。 筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。 菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆。,目前常用的产酶微生物及所产生的酶,四、酶在医药领域的应用,1、在疾病诊断方面的应用 葡萄糖氧化酶 -葡萄糖酸和过氧化氢 -过氧化氢酶 -水和原子氧 -无色的化合物氧化成有色的化合物 2、在疾病治疗方面的应用 溶菌酶-分解病原菌的细胞壁-

6、抗菌和消炎作用；尿激酶；SOD 3、在药物生产方面的应用：青霉素酰化酶 4、在分析检测方面的应用：多酚氧化酶传感器,第二节 酶和细胞固定化,酶直接加入至溶液中，酶自身的空间结构不发生改变，保持自己的生物特性。 优点：酶解效率高、使用比较方便，特别是在大批量样品处理时。 缺点：不能重复使用、自身酶解、寿命短,自由酶 (Free Enzyme),第二节 酶和细胞固定化,一、固定化酶的制备 固定化酶（immobilized enzyme） ： 指限制或固定于特定 间位置的酶，具体来说，是指经物 理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。 （细胞固定化、固定化细

7、胞）,固定化酶的特点 具有生物催化剂及固相催化剂的功能。 （1）可以多次使用，酶的稳定性提高； （2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。 （3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制； （4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少； （5）比水溶性酶更适合于多酶反应。,优点,固定化酶的缺点：,(1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 (2)比较适应水溶性底物和小分子底物。 (3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后才能固定化。,酶和细胞固定化：,定义:通过载体等将酶限制或

8、固定于特定的空间位置，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。 固定化方法： 1.载体结合法 2.交联法 3.包埋法 4.选择性热变性法,酶和细胞固定化方法 酶和细胞固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 网格型 微囊型 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理（细胞）,酶和细胞的固定化方法,（1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。 A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。 优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。 缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行

9、关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。,B、离子结合法： 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。 优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。 缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。,酶和细胞的固定化方法,C、共价结合法：,酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。 缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。,酶和细胞的固定化方法,（2）交联法：用双功能

10、或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。 分为：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。 常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。 （3）包埋法： A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。 常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。,酶和细胞的固定化方法,B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法

11、：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。,酶和细胞的固定化方法,载体结合法 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 载体结合法 包埋法 网格型 微囊型 选择性热变性法,方法总结,各种酶固定化方法的比较,酶的固定化方法,图 711 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,胶格包埋法,首先被采用的胶格包埋法是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶 Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发

12、剂inactiation,Masaru Kato, et al. Anal. Chem. 2005, 77, 1813-1818,Coating of the Silica Monolith with Trypsin-Encapsulated Gel.,Synthesize silica monoliths,Mix with trypsin and a fully or partially hydrolyzed silane, SiOH4-n(OMe)n.,包埋法(Entrapment),4、酶和细胞的固定化载体,（1）吸附载体：无机物和有机物，见P224表6-1。 （2）包埋载体：卡拉胶、海

13、藻胶 （3）共价结合载体：纤维素、琼脂、琼脂糖。 载体应具备的条件： （1）固定化过程中不引起酶变性； （2）对酸碱有一定的耐受性； （3）有一定的机械强度； （4）有一定的亲水性和稳定性； （5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀； （6）共价结合时有可活化基团； （7）有耐受酶和微生物细胞的能力： （8）廉价易得。,5、固定化酶的制备技术,（1）吸附法制备技术：将酶的水溶液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。 （2）包埋法制备技术： 凝胶包埋：先将凝胶材料与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点以下的温度，然后假如预保稳的酶液，混合均匀，最后冷却凝固成型和破碎即成

14、固定化酶。,5、固定化酶的制备技术,微囊化包埋：将酶定位于具有半透膜的微小囊内。半透膜厚约20nm，膜孔径40 nm ,其表面积与体积比很大，包埋酶量也多。 （3）交联法制备技术：向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶分子内或酶分子间彼此连接成网格人结构而形成固定化酶。反应速度与酶的浓度、试剂的浓度、PH、离子强度、温度和反应时间有关。 如：0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛在pH5.2-7.2，0C，24h即完成反应。,酶和细胞固定化模式,二、固定化细胞的制备 固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。 被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。

15、,固定化细胞的特点 有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。 无须进行酶的分离纯化 保持酶的原始状态，酶回收 率高 比固定化酶稳定性高 细胞内酶附助因子可再生 细胞本身含多酶体系 抗污染能力强,优点,固定化细胞的缺点：,(1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。 (2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。 (3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。,固定化细胞的制备技术 载体结合法 是将细胞悬液直接与水不溶性的载体 相结合的固定化方法。 载体：主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，

16、不影响细胞的生长及酶活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 包埋法 将细胞定位于凝胶网格内的技术。与包埋酶法相同。,交联法 用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。 交联剂戊二醛等对细胞有毒性，很少用。 无载体法 靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。,三、固定化方法与载体的选择依据 固定化方法的选择 固定化酶应用的安全性：按照药物和食品检验标准检查。试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。 固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。 固定化的成本：包括酶、载体、

17、试剂的费用，也包括水、电、气、设备和劳务投资等。 载体的选择：最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体。,四、固定化酶的形状与性质 固定化酶的形状 颗粒状固定化酶：方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶铢。 纤维状固定化酶：比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 膜状固定化酶：通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。 管状固定化酶：酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。,固定化酶的性质 （1）酶活力的变化：活力大都下降。主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空

18、间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。 （2）酶稳定性的变化：对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。稳定性提高，有效寿命延长。 A、操作稳定性：能否实际应用的关键因素，半衰期达到1个月以上时，即具有工业应用价值。 B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存。,C、热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。 D、对蛋白酶的稳定性：蛋白酶的耐受力有所提高。原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。 （3）酶学特性的变化 A、底物专一性：对底物的专一性下降。 B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小。 C、最适温度：一般升高。原因是固

19、定化后空间结构更为稳定。 D、米氏常数(Km) ：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。 E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。,定义：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置称为酶反应器(Enzyme reactor)。 作用：以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定的产物。 与化学反应器相比：在低温、低压下发挥作用，反应时的耗能和产能较少。 与发酵反应器相比：不表现自催化方式（即细胞的连续再生）。,第三节 固定化酶和固定化细胞的反应器,一、反应器的类型和特点 （一）搅拌罐型（Stirred Tank Reacter, STR） 由反应罐、搅拌器和保温装

20、置组成。 1. 分类： 1）分批搅拌罐式反应器(Batch Stirred Tank Reactor, BSTR) 适用的酶：游离酶、固定化酶 2）连续流搅拌罐反应器(Continuous Flow Stirred Tank Reactor, CSTR) 适用的酶：固定化酶,（二）固定床型（也称填充床，Packed Bed Reactor, PBR ） 把颗粒状或片状等固定化酶填充于固定床内，底物按一定方向以恒定速度通过反应床。,（三）流化床型(Fludized Bed Reactor, FBR) 适用于：固定化酶。,各种反应器的示意图,一、 酶化学修饰的概念 酶的化学修饰（chemical

21、modification）： 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。,第四节 酶的化学修饰,二、酶化学修饰的目的 1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。,三、酶化学修饰的种类 酶的表面化学修饰 （一）大分子修饰（大分子结合修饰） 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。,2. 修饰剂： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。,（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰） 定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。 侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。