基因工程实验指导2009版

1、广东省高等教育厅核心实验室现代生物技术实验室实验教材基因工程实验地图(本科教材)华南农业大学现代生物技术实验室基因工程实验丢失2009年4月编辑的话本实验图是为广东省高校厅重点实验室之一“现代生命技术研究所”开设的“基因工程原理和方法”而编写的。本课程主要面向广州石牌地区6所高校的研究生，还包括部分高年级本科生。本课程以实验为主，要求所有学员提前完成“分子生物学”或“分子遗传学”，以便学生在选修本课程时有较好的理论基础。本课程实验采用了一致的实验系统(用质粒载体克隆植物DNA片段)，学生掌握了DNA体外重组的基本技术训练(实验1-7)。另外，根据本研究室多年的教育研究经验，我们将近年来遗传工程

2、技术发展的PCR、Southern杂交技术等纳入实验内容，确保学生完成本课程后能更快地开展相应的研究工作，更好地适应今后研究工作的需要。(莎士比亚，北境外)。本实验地图由张楚雄、穆红、李继才、姚下午安、吴虎、将军宇、刘耀光、梅万通等教师参与编写，李继才老师负责指导书的编辑等。本实验地图是考试用的第三版，考试后将根据各学校的选课过程和要求做进一步修改。请兄弟大学的同行们多多提出宝贵的意见。(David aser，Northern Exposure)编辑2005年2月目录基因工程实验室学生代码3实验碱分解法提取质粒DNA 4实验琼脂糖凝胶电泳7实验3 DNA酶9实验4目的片段回收11实验5 DNA

3、体外连接12实验6重组DNA的转基因15实验7重组变压器的快速鉴定18实验八聚酶链反应(PCR) 19附录一.各种试剂的母液公式28附录二。常用实验设备的清洗方法31主要参考书32基因工程实验室学生守则1.实验课前必须预习实验地图，了解实验原理和基本操作过程。实验课无缘无故缺席、迟到或早退渡边杏。郑智薰时间表上规定的实验时间要按照林老师的安排及时操作。3.实验课要自觉遵守课堂纪律，保持实验室安静清洁的卫生，渡边杏大声谈笑，吸烟，随地乱扔纸屑，吐痰，渡边杏。4.实验前要检查仪器、工具、试剂，实验台随时要整齐、仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完了，必须立即盖上盖子，放回原处。试剂，不要把药品洒在实验

4、台和地板上。5.在实验中要严格遵守操作规程进行实验，细心观察实验现象，如实记录实验结果。每次实验完成后，都要写实验报告。6.实验结束后，要好好清洁当天使用的器皿和工具，整理仪器和实验台，然后经过林和教师的同意离开。7.使用仪器、药品、试剂及各种其他物品时要注意节约。洗涤和使用机器时要小心，以免损坏机器。8.废液倒入水槽，同时喷出水，喷出江珊、强碱等腐蚀性液体，先用水稀释，然后倒入水槽，让水流出。废纸等其他固体废弃物应倒进水槽渡边杏，倒进垃圾桶。9.严禁擅自使用非当日实验所需的仪器和物品，使用仪器要严格按照仪器使用的程序进行，贵重仪器要在林老师的指导下操作。实验过程中机器出了故障，要立即向林和老

5、师报告情况。例如，违反使用规定造成的损失，用户负责维修和赔偿。10.每一个实验课，任课教师轮流值班，值班生当天负责实验室的卫生、安全、所有服务工作，最后关闭水电、门窗，经过林课教师的检查同意后才能离开。实验碱分解法提取质粒DNA一、目的学习和掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA提取方法。二、原则质粒DNA提取一般使用碱分解法、煮沸法、SDS法、三唑酮-溶菌酶法等，其中碱分解法最常用。该方法具有质粒DNA产量高、速度快等优点。其原理是，在：碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构被破坏，产生变性，但质粒DNA分子量相对较小，环状超螺旋结构导致两个互补链在高碱性pH条件下也没有完全

6、分离，如果放入中和液，变性质粒DNA就会恢复到原来的配置。线性大分子质量细菌染色体DNA没有报复性，形成细胞片段、蛋白质、SDS等不溶性复合物。通过离心沉积可以去除细胞碎片、染色体DNA和大部分蛋白质等，质粒DNA和小分子量的RNA留在上清液中。混杂的RNA可以用RNA酶(RNaseA)去除。用苯酚/氯仿处理，可以去除残留蛋白质。三、实验材料含有质粒pBluescript II的大肠杆菌BH10B。四、设备和设备高压灭菌锅初顺工作台恒温晃动。台式离心机(制冷或郑智薰董洁)涡流振荡器五、实验工具培养用试管测量桶冰盒几根微量离心管微量拔出器吸管。六、试剂(准备方法见附录)LB培养基氨苄西林(Amp

7、，100 mg/ml) 20% SDS溶液I溶液II(目前最好使用)；溶液III(-20预冷)4 N NaOH 3 M NaAc(pH5.2)无水乙醇TE缓冲区(pH 8.0) RNase A(10 mg/ml) 70%乙醇饱和苯酚/氯仿/异丙醇(2533602433:1，注：本实验指南的其他章节省略为苯酚/氯仿，“氯仿是指增加了1/24体积的异丙醇”。）七、实验阶段1.细菌培养(1)准备LB液体和琼脂培养基，进行高压灭菌。(2)在含有Amp 100 mg/ml的琼脂培养基板(下划线或涂布)上培养单菌落(37 C，1820小时)。(3)将含有Amp 100 mg/ml的LB液体培养基(45 m

8、l/管)放入培养基中，将单体放入培养基中。把培养管斜插在摇床上，摇晃37，过夜(约200 rpm，1416小时，通常不超过18小时)。需要大量提取的情况下，选择单细胞，连接到装有50MLB培养基的三角瓶，在37时摇晃18小时。质粒DNA提取(如果使用制冷离心机，请设置为4 预冷)将1.5毫升菌液吸入1.5毫升离心管。离心(5000 rpm，2分钟)，放弃清液。如果你想再提取一些DNA，就把1.5毫升的菌液扔出同一个离心管，离心力，清液。用移动器尽量去除清液。加入150毫升溶液I，用旋流振荡器充分释放菌体。加入250毫升溶液II，慢慢上下翻转离心管，轻轻搅拌10多次。室温下放置5分钟。加入180

9、 ml预冷溶液III，上下翻转离心管。10多次，轻轻混合。冰浴在10分钟，或-20冰箱里放5分钟左右(不要冻得太久)。离心(12000 rpm，5分钟，4C)。(离心后，将离心机温度设定为20 。）去除上清液。2/3倍苯酚/氯仿萃取，离心(12000 rpm，5分钟)。去除上清液(约500 550毫升)，2倍体积的无水乙醇(大量提取时上清液的容量大，以0.6倍体积代替乙醇，混合异丙醇)。离心(12000 rpm，5分钟，室温)，倒入酒精。离心力在几秒钟内用移动器尽可能地除去酒精。用0.5毫升70%酒精沉淀一次DNA，在离心2分钟内倒入酒精。离心力几秒，用移动器尽可能地除去酒精，干燥10分钟。添

10、加50100 ml TE(含20 mg/ml RNaseA)溶解DNA沉淀。37C放置几个小时，-20C保存备件。高辐射质粒DNA的产量一般为3-5mg/ml菌液。这种DNA可以直接用于限制性内切酶切等反应。如果需要更高纯度的DNA，可以进一步纯化。质粒DNA的进一步纯化添加TE使DNA溶液达到100毫升，加入100毫升苯酚/氯仿，充分振动。离心(12000 rpm，5分钟)，吸收上清液。加入1/10体积的3 M NaAc，加入体积的预冷绝对乙醇2倍混合。在-70oC冰箱里放大约10分钟以上，或者在-20oC冰箱里放30分钟到几小时左右。离心力(12000 rpm，15分钟，4oC)，倒入酒精

11、，离心力几秒钟，用移动器最大限度地去除酒精。用0.5毫升70%酒精沉淀一次DNA，在离心2分钟内倒入酒精。离心力在几秒钟内用移动器尽可能地除去酒精并干燥。添加50100 ml TE溶解DNA沉淀。(大量提取质粒DNA，溶液I，II，III的使用量可能会相应增加。例如，如果培养液为50毫升，则溶液I、II、III的用量分别为2.0毫升、4.0毫升和3.0毫升。）用这种实验方法提取和纯化的质粒DNA纯度只能满足一般目的的要求。如果纯度高(例如用作复制载体和排序的模板)，建议使用制造商提供的质粒纯化套件进行提取。八、实验注意事项1.高压消毒要由专人管理，压力为0.5磅时拔掉电源插头，加热到1.0磅，

12、保持20分钟(通过，切断开关控制)。2.使用灭菌工作台前，请打开紫外线灯消毒，打开紫外线灯时不要打开北风装置。3.抗菌药物不能使用高温灭菌。培养基灭菌后要降温，直到没有热孙怡。4.为了避免细菌污染环境，额外的菌液煮杀后再倒入水槽。5.加入溶液II，溶液III，搅拌好的时候一定要柔软，剧烈搅拌渡边杏。6.在苯酚/氯仿萃取后吸清液时，要注意不要吸入下层苯酚/氯仿。但是不要留下太多的上清液，让DNA损失更多。(本杰明富兰克林，DNA名言)九、实验日程1.第一天下午准备液体和琼脂培养基。(5:30)在琼脂培养基板上划线，熬夜培养短杆菌生长。2.第二天下午(5336030)，选择单细胞乳酸菌，通宵培养。

13、3.上午停止培养9:00左右，在室温或4下保管。下午提取质粒(纯化在实验2电泳过程中进行)。实验琼脂糖凝胶电泳一、目的学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的纯度、浓度和分子量。二、原则琼脂糖是溶解在沸水中的天然聚合长链分子，45开始形成多孔刚性过滤孔，凝胶孔径的大小由琼脂糖的浓度决定。DNA分子在碱性环境中带负电荷，加上电场作用，向两极游泳。DNA分子在琼脂糖凝胶中游泳时有电荷效应和分子筛效应。根据DNA，分子量的大小和构成不同，电泳的游泳率不同，分成不同的乐队。琼脂糖凝胶电泳分离DNA主要利用分子体效应，移动速度与分子量的大数值成反比。溴化B (EB)是扁平的分子，在紫外

14、线中发出荧光。EB可以与DNA分子形成EB-DNA复合物，其释放的荧光强度比自由状态EB释放的荧光强度大10倍以上，荧光强度与DNA含量成正比。用肉眼观察，可以检测5 ng以上的DNA。质粒DNA有三种结构，环状的超螺旋、开环和线性，移动速率因电泳而异(超螺旋线性开环)。三、实验材料上次实验提取的质粒DNA。四、实验设备微波电泳微电泳槽紫外透射检测仪五、实验工具微量萃取器吸管头几个附加模板。两桶100 ml1三角瓶500 ml1透明胶带六、试剂(准备方法见附录)每个阵地10TBE电泳缓冲液10再型缓冲液EB母液(0.5MG/ML) DNA (HIND )七、实验阶段1.制作胶水(1)将0.8 g琼脂糖放入包含100 ml 1TBE电泳缓冲液的500 ml三角瓶中，摇晃得很好，用电子秤测量三角瓶的总重量。在微波炉或电炉中加热至琼脂糖完全融化，在天平上加入蒸馏水，添加到原来的重量。冷却到