荧光染料选择和数据分析

1、荧光染料的选择和数据分析，张辛梅From BD Biosciences，荧光染料的选择，在流动状态下检测颗粒性物质的各种物理和生物特性的仪器。流式细胞仪原理、传感信号散射光信号前向散射光信号(FSC)侧散射光信号(SSC)荧光信号、流式细胞仪原理、散射光信号粒子通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的正向角度散射信号(FSC)。垂直于激光束的横向角度散射信号(SSC)。流式细胞术原理，前角散射信号(FSC) FSC反映细胞大小，一般细胞越大，前角散射信号越强。FSC信号与细胞的折射率有关。可以用来表示细胞凋亡。可以用来在区分死/活细胞时设置门。流式细胞术原理，侧角散射光信号(

2、SSC) SSC信号主要反映细胞的内部结构，内部结构越复杂，SSC信号越强。流式细胞术原理，FSC和SSC信号用于检测和显示细胞的物理特性。流式细胞术、荧光信号荧光抗体或其他染料染色的粒子通过激光束时，染料吸收光子，转移到这里，返回纪宁状态时，染料释放能量，大部分以光的形式释放。这种发射的光称为荧光。流式细胞术原理、流式细胞术原理、流式细胞术特性和检测标本，可进行特异性、高灵敏度、速度和多参数分析。可检测的样本种类包括：(1)外周血、骨髓、细针穿刺、洗涤剂、实体组织、培养细胞(2)新！血清、血浆、培养相青、细胞分裂液、荧光染料选择的必要性、多色流式细胞仪的开发促进了新荧光染料的发现和抗体标记物

3、的发展，但抗体组合选择非常复杂。如果随意选择荧光素配制的抗体，就不能得到适当的结果。进一步考虑荧光染料的选择，可以避免重复实验和错误的结果。流式细胞术原理，荧光信号，这里波长，荧光素，发射波长，了解你的仪器，基本要求-了解你的仪器，试剂选择从了解你的仪器配置开始激光，但更多的干扰光，荧光染料，488纳米激光刺激的染料，荧光染料，633nm了解荧光素的性质，了解荧光素的相对荧光强度，了解荧光素/单抗结合物的亮度，了解各种荧光素对BD LSRII流式细胞系的染色指数，了解荧光素的相对荧光强度，各荧光素的相对荧光强度对确定的单抗剂有所不同。由于组合的荧光素不同，阳性/阴性细胞的S/N比率可能相差4-

4、6倍，了解荧光素的相对荧光强度，每个荧光素的相对荧光强度不同。荧光素的相对荧光强度也不同。了解荧光素的相对荧光强度，F/P比抗体中荧光素分子的数量(F/P)也影响相对荧光强度。FITC和PerCP的结合物通常在一个抗体分子中结合几个(2-9个，取决于抗体)荧光素分子。APC与PE和抗体的结合通常为1: 1。复合染料PE-CY7和APC-CY7通常由PE/APC分子结合多个CY7分子，PE/APC分子与抗体1: 1结合，而复合染料PerCP-CY5.5、PerCP和CY5.5的比例为1: 1。因为荧光，复合荧光染料-tandem dye，isolated Donor，donor distance

5、 too great，donor distance correct条件需要提供高S/N比率的荧光素，例如PE/APC。选择荧光素时要考虑。自发荧光角细胞群有徐璐不同水平的自发荧光。所有荧光通道都能观察到自发荧光，但是自发荧光强度随着波长的延长而迅速降低。对于自发荧光强的细胞，如果选择波长长的荧光素(例如APC)，S/N比率更好。对于自发荧光弱的细胞，发射波长长的荧光素对S/N的提高没有明显的改善。FITC是可选的。荧光素选择要考虑非特异性地结合大量荧光抗体会产生低水平的非特异性结合，导致女性细胞群的荧光超出自发荧光。非特异性结合引起单克隆抗体的同型抗体。一些IgG同型抗体可能与某些细胞的Fc受

6、体结合，荧光素羰基化染料(如CY3，CY5，CY5.5，CY7)和Tex-Red直接抗体以及一些复合染料标记的抗体在显示特定子集的细胞时，有时会提高结合率。因为在CY5的情况下，这种染料与低亲和性FC受体的极低亲和性相互作用。这也是复合染料PE-CY5的特性。选择荧光素时要考虑的复合染料：信号衰减复合染料由于光、固定剂或温度上升，信号衰减，复合染料在上层染料中发光。这种现象从一小部分开始，导致APC或PE染色细胞群的假阳性。减少样品暴露在光、高温或固定剂下，可以大大避免这个问题。选择染料的注意事项：复合染料的信号衰减不会降低APC或PE的灵敏度。如果是这样，就应该选择其他试剂组合。如果需要固定

7、样品，选择稳定的固定剂可以有效地防止复合染料的信号衰减。BD: 338036，荧光素选择，仪器配置的差异，多色分析不能同时选择“最亮”荧光素，但对于特定仪器，可以根据荧光的强弱列出可选染料亮度的判断。荧光染料的灵敏度是区分背景和弱阳性信号的能力影响背景的因素包括探测器的电子噪声、细胞自发荧光，这些因素还增加了语音荧光棒的宽度(标准偏差)，灵敏度好的标准是染色指数。DW，D是指两性杆和阴性杆的平均荧光强度差异。w是女性棒的2SD。荧光素选择应考虑荧光信号之间的干扰。信号检测背景荧光信号强的细胞群的SD大于荧光信号弱的细胞群。多色分析时，荧光素(如FITC)的光泄漏到相邻荧光素(如PE)的探测器上

8、。漏出的光线越多，需要校准的东西越多，对分辨率的影响就越大。特别是弱表示的信号。，考虑荧光素选择，多色荧光信号之间的干涉，考虑荧光素选择，多色荧光信号之间的干涉IFN APC CD8 APC-CY7 CD4 PE IL-2PE-CY7，考虑荧光素选择，多色荧光信号之间的干涉IFN APC CD4 PE IL-2PE多色荧光信号组合荧光素选择，一般6，8试剂组合有效且真实控制：比较单荧光抗体染色和试剂组合染色结果，防止试剂组合中的其他试剂影响结果。 荧光控制(fluorescence-MINUS-one control，FMO):移除一个荧光抗体，组合所有其他试剂。荧光素选择原则，上述原则可能会

9、徐璐冲突，但为了获得最佳结果，必须实现平衡。原则1:选择最适合仪器配置的“亮”荧光染料的原则2:选择光谱重叠最小的荧光素的原则3:为最暗的抗体选择最亮的荧光素，反之亦然、数据分析、数据分析、测试指标阳性百分比(%)绝对数量(g/L)平均荧光强度(MFI)、数据分析、直方图和点图、数据分析、限制感兴趣细胞群的语句设置FSC到SSC点图是传统上用于设置语句的图。分析淋巴细胞群时，CD45 vs SSC粘度设计语句优于FSC vs SSC粘度设置语句。数据分析，语句设置-确定要分析的目标细胞系列，数据分析，语句设置，数据分析，语句设置，数据分析，样本比较，样本测试，数据分析，直方图统计表，数据分析，

10、样本测试，数据分析，样本比较，样本测试，样本测试图1，数据分析中出现的问题，对照管直方图左侧与检查员重叠。但是检查员直方图右侧是肩峰，两条曲线分开。正曲线减去语音曲线的假阳性率阳性率(近似值)和平均荧光强度或弱阳性，图2，数据分析中出现的问题，比较官与检查官直方图形状相同，但是检查官直方图的右移无法记录该结果。除平均荧光强度外，非特异性染色曹征抗体效价确认，图3，数据分析中出现的问题，组合图形需要设置边界。边界右侧是强阳性，是可报告的百分比。弱阳性分析见上述原则3，图4。数据分析中出现的问题，阳性细胞群和女性细胞群明显分开，在该象限内以女性对比线定位，使其他3个象限内的假阳性率小于2%。阳性率，强阳性或平均荧光强度，图5，数据分析中出现的问题，阳性组和女性组的区分明显，但阳性组部分通过2象限单阳性部分使用图5原则双阳性部分，根据细胞组方向使用图7/图8原则，图6，数据分析中出现的问题，使用阳性组左侧对比，阳性样本的比例减去假阳性；阳性百分比(近似值)，弱阳性或平均荧光强度，图7，数据分析时出现的问题，阳性群体与对比度一致，部分重叠，但转换为阳性象限