2017第九章 PCR引物及杂交探针设计

1、PCR引物及杂交探针设计 主讲教师：赵雨杰,DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。,在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火（复性）-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至9095一定时间后，使

2、模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至5060，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于7075，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。,重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。（230=10737418

3、24）,PCR反应五要素：,引物 酶 dNTP 模板 缓冲液（其中需要Mg2+),PCR引物的设计原则,1. 引物应用模板核酸序列保守区内设计并具有特异性。 2. 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段，产物不能形成二级结构。 3. 引物长度一般在1530碱基之间。 4. G+C含量在40%60%之间。,5. 碱基要随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 6. 引物自身不能有连续4个碱基以上的互补。 7. 引物之间不能有连续4个碱基以上的互补。 8. 引物5端可以修饰。 9. 引物3端不可修饰。,PCR引物区域选择,Primer3Plus 主讲

4、教师：赵雨杰,Primer-BLAST 主讲教师：赵雨杰,/tools/primer- blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome,实时定量RT-PCR 主讲教师：赵雨杰,实时定量PCR原理,所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,1. TaqMan荧光探针: PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发

5、射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变(SNP)，有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。,2. SYBR荧光染料: 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的

6、增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。,3. 分子信标:是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。,根据mRNA序列设计RT-PCR 引物,1、引物和探针的特异性 2、引物扩增的效果 3、扩增产物在mRNA的位置 4、能否鉴别基因组DNA的污染,数据库查询RT-PCR引物方法,GenScript Real-time PCR (TaqMan

7、) Primer Design Https:/,/primerbank/,DNA甲基化特异性 PCR引物设计 主讲教师：赵雨杰,亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变。,MSP需要特殊要求：,1、甲基化引物、非甲基化引物。Tm差异不能太大。 2、甲基化引物和非甲基化引物带有至少一个CpG序 列，越多甲基化位点越好。至少有一个CpG序列在引物3端。最好设计一对野生型引物来验证模板。,3、M和U同时出现条带，说明这个甲基化位点是半甲基化的，或者你的模板没修饰完全。4、MSP的可

8、靠性，最终还是要用测序来确定。,MethPrimer,甲基化PCR引物设计软件 /cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi,碱基增加1000,miRNA数据库检索及实验设计 主讲教师：赵雨杰,Micro (mi)RNAs are small, highly conserved noncoding RNAs that control gene expression post-transcriptionally either via the degradation of target mRNAs or the inhibition

9、 of protein translation.,Each miRNA is believed to regulate the expression of multiple mRNA targets, and many miRNAs have been linked to the initiation and progression of human cancer. miRNAs control various activities of the immune system and different stages of hematopoietic development, and their

10、 misexpression is the cause of various blood malignancies.,Certain miRNAs have oncogenic activities, whereas others have the potential to act as tumor suppressors. Because they control fundamental processes such as differentiation, cell growth and cell death, the study of the role of miRNAs in human

11、 neoplasms holds great promise for novel forms of therapy.,miRNAmap .tw/ 主讲教师：赵雨杰,miRBase / 主讲教师：赵雨杰,miRNA引物设计 主讲教师：赵雨杰,由于miRNA序列较短； 由于miRNA存在成熟和颈环序列； 用实时定量PCR检测生物样品中某种miRNA含量引物设计是比较特殊的； 首先，需完成miRNA逆转录；然后，进行扩增。,1、Oligod(T)特异的RT引物（QIAGEN产品为主）,由特异序列(T)20

12、左右兼并碱基V或VN组成。但是RNA在反转录前需要进行末端Poly(A)加尾，所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的RT引物，该引物含有一段PCR引物。另外一条引物3 端含有6-8个目标miRNA5端碱基序列，再加一段随机序列，以确保引物的Tm值在60左右。,2、茎环状结构的RT引物（ABI产品为主）,由可以自身呈环茎状的特异序列6到8个miRNA3端反向互补碱基组成。(一条miRNA序列特异对应一个茎环状结构的RT引物）。另外一条引物3端含有6-8个目标miRNA5端碱基序列，再加一段随机序列，以确保引物的Tm值在60左右。,美国signosis公司的一种新方法,美国Signosis开发了一种高灵敏、高分辨的实时PCR方法，用于检测miRNA的表达，其应用寡核苷酸连接和基于实时PC