药物分析中新型样品前处理技术-2013

1、1,药物分析中新型样品前处理技术,2,为什么要进行前处理?,3,为什么要进行前处理?,4,为什么要进行前处理?,5,6,前处理的主要目的,净化 浓缩 增强响应、提高选择性（比如化学衍生）,浓缩痕量的被测组分，提高方法的灵敏度，降低检测限； 去除样本中的基体与其他干扰物质； 通过衍生化，使被测物转化成为检测灵敏度更高的物质或转化为与样本中干扰组分能够分离的物质，提高方法的灵敏度和选择性 保护下游分析仪器以及测试系统、避免影响整机性能及寿命,7,传统样品前处理方法,液液萃取,蒸馏,索氏萃取,沉淀,离心,大量使用有机溶剂,处理时间长,操作步骤多,较大误差,影响操作人员健康,污染周围环境,8,样品前处

2、理的发展趋势,减少甚至不用有毒有机溶剂 能适应处理复杂介质、痕量成分、特殊性质成分分析的要求 减少操作步骤 尽量集采样、萃取、净化、浓缩、预分离、进样于一身,9,前处理的新方法有哪些？,10,新型样品前处理技术,固相萃取 solid phase extraction (spe) 基体分散固相萃取 matrix solid phase dispersion extraction(mspde) 固相微萃取 solid phase microextraction (spme) 搅拌棒式吸附萃取 (stir bar sorptive extraction, sbse ) 液相微萃取 liquid ph

3、ase microextraction (lpme) 加速溶剂萃取 accelerated solvent extraction (ase) 微波萃取 microwave assistanted extraction (mae) 超临界流体萃取 supercritical fluid extraction (sfe),11,固相提取技术solid phase extraction (spe),两相 液相与固相（液相色谱基础） 多种吸附剂可供选择 反相最常用！ 正相 离子交换 具有高选择性的新型吸附剂 溶剂消耗少 （与液液提取相比） 易自动化,12,固相萃取,净化与富集效果好 样品制备快速、涉及

4、人工少、溶剂用量少 分析结果的精密度提高(偏差常 5%) 多样化的产品设计迎合不同样品通量要求,13,14,hplc 与spe之区别,hplc,spe,颗粒直径,5 m,40-80 m,柱床效率,high,low,柱外体积,low,high,柱长,5-30 cm,1 cm,塔板数 (n),10,000, 50,hplc能分离相似性的化合物； spe要求待分离物质与干扰物质选择性区别大,15,spe 产品常见形式,萃取小柱: 小柱体积 135ml, 吸附剂重量 10mg6g 为中等数量样品设计 食品安全、环境分析和研究实验室,96-孔板: 吸附剂重量260mg 为高通量分析设计（dmpk/ba/

5、be实验室） elution板用于微量样品和高灵敏度分析,在线spe净化柱: 柱芯式(需sentry guard套件) 和标准柱 由切换阀和软件控制，无需人工操作,16,固相提取技术的基本要求,样品必须呈液态 驱动力(driving forces)操作方式 重力 压力 真空,17,spe技术的驱动力：重力,重力,18,spe技术的驱动力：压力,压力,19,resevoir with adapter,spe技术的驱动力：真空,20,spe技术填料颗粒基质,硅胶基质键合各种官能团 如，c18, c8, nh2, qma . 不规则填料 小柱(cartridges)： 40 - 80 m disks

6、：8 -10m 活性碳 碳纳米管 石墨烯 ,21,spe的类型 分析物与非极性固定相的作用力,nh2,so3-,van der waals forces,silica base,bonded functional group (c8),22,血清中马兜铃酸代谢产物分析,anal. methods, 2013, 5, 718-721,23,schematic diagrams of the packed bed and impregnated membrane analyte concentrators proposed in this paper for ce analysis of sulf

7、onamides.,lara et al. j. chromatogr. a, 1216 (2009) 33723379,determination of sulfonamide residues in water samples by in-line solid-phase extraction-capillary electrophoresis,24,lara et al. j. chromatogr. a, 1216 (2009) 33723379,25,evaluation of a molecularly imprinted polymer as in-line concentrat

8、or in capillary electrophoresis,26,固相微萃取（solid phase microextraction, spme）,基本原理：固液分配 优点：操作简便、快捷、绿色,spme是一项新颖的样品前处理与富集技术, 属于非溶剂型选择性萃取法。 装置类似于一支气相色谱的微量进样器, 萃取头是在一根石英纤维上涂上固相微萃取涂层, 外套细不锈钢管以保护石英纤维不被折断, 纤维头可在钢管内伸缩。将纤维头浸入样品溶 液中或顶空气体中一段时间, 同时搅拌溶液以加速两相间达到平衡的速度, 待平衡后将纤维 头取出插入气相色谱汽化室, 热解吸涂层上吸附的物质。被萃取物在汽化室内解吸后

9、, 靠流 动相将其导入色谱柱,完成提取、分离、浓缩的全过程。spme几乎可以用于各类挥发性或 半挥发性物质的分析。,spme主要针对有机物进行分析，根据有机物与溶剂之间“相似者相溶”的原则， 利用石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用，将组分从试样基质中萃取出来， 并逐渐富集，完成试样前处理过程。,27,spme装置示意图,28,spme操作流程示意图,29,spme 基本理论,kfs , distribution constant of analyte between coating and sample matrix n , analyte mass adsorbed on coat

10、ing vf.vs , coating volume and sample volume, respectively c0 , initial concentration of analyte in matrix,30,spme的特点,无需或仅需极少洗脱溶剂,快速,所需样品体积少,装置简单、易操作,易于自动化、易于和其他技术联用,31,spme发展历程,1990 pawliszyn waterloo university, spme-gc,1993 supelco commercial spme-gc,1995 pawliszyn spme-hplc,1996 supelco commerci

11、al spme-hplc,1997 pawliszyn in-tube spme-hplc,32,33,spme发展历程,1990 pawliszyn waterloo university, spme-gc,1993 supelco commercial spme-gc,1995 pawliszyn spme-hplc,1996 supelco commercial spme-hplc,1997 pawliszyn in-tube spme-hplc,34,35,spme相关参数,解析模式： 气相色谱进样器：热解析（高温） 液相色谱、毛细管电泳：流动相解析 萃取模式： 选择主要与待测物的挥发

12、性、基质和探针固定相涂层的性质有关 顶空萃取、直接萃取 顶空萃取：对挥发性特别强的样品,可采用顶空或空气萃取 直接萃取：对于半挥发性和不挥发性样品来说，应采用直接萃取 影响因素（对干扰分析物吸附和解析的因素）： 固定相类型、 萃取时间、 离子强度、 ph值、 温度、 样本体积和搅拌方式。 对于spme-gc，分析物解析与时间和温度有关， 而对于spme-hplc，分析物解析则主要与溶剂类型、体积和时间有关。,36,spme装置类型,37,spme萃取模式,schematic representation of the principle of direct immersion (a) and

13、headspace (b) nd-spme for determination of free concentrations.,38,fiber spme,制备相对简单 操作简便 富集倍数有限 不易自动化,纤维涂层、纤维材料是关键,39,各种不同的fiber spme,scanning electron micrograph of the solgel tbot/peg/tea fiber.,40,各种不同的fiber spme,a new poly(phthalazine ether sulfone ketone)-coated fiber forspme to determine nitr

14、oaromatic explosives in aqueous samples, wenna guan et al. j. chromatography a, 1147 (2007) 5965,41,各种不同的fiber spme,in situ fabrication of nanostructured titania coating on the surface of titanium wire: a new approach for preparation of solid-phase microextraction fiber, gui-bin jiang et al. analyti

15、ca chimica acta 6 1 1 ( 2 0 0 8 ) 5661,42,各种不同的fiber spme,sem images showing the surfaces of cnt films prepared in ethanol.,43,各种不同的fiber spme,preparation of single-walled carbon nanotube fiber coating for spme of organochlorine pesticides in lake water and wastewater, j. sep. sci. 2007, 30, 2138 21

16、43,44,各种不同的fiber spme,hydrofluoric acid etched stainless steel wire for solid-phase microextraction, anal. chem.,chromatograms of (a) river water 1 with spiking of 10 g iphenyl; (b) river water,45,各种不同的fiber spme,unbreakable solid-phase microextraction fibers obtained by sol-gel deposition on titani

17、um wire, anal. chem. 2006, 78, 2071-2074,46,各种不同的fiber spme,photopolymerized microtips for sample preparation in proteomic analysis, electrophoresis 2004, 25, 38403847,47,各种不同的fiber spme,photopolymerized microtips for sample preparation in proteomic analysis, electrophoresis 2004, 25, 38403847,48,各种

18、不同的fiber spme,monolithic microextraction tips by emulsion photopolymerization, journal of chromatography a, 1216 (2009) 22822287,49,各种不同的fiber spme,monolithic microextraction tips by emulsion photopolymerization, journal of chromatography a, 1216 (2009) 22822287,50,spme涂层制备技术,理想萃取涂层应具备 热稳定性高、样品容量大、萃

19、取和解吸速度快 涂层性能不仅跟其本身有关，还与其制备技术密切相关 物理沉积法 溶胶凝胶法 电化学沉积法 衍生法 直接使用,51,sol-gel法涂层制备技术,52,搅拌棒式吸附萃取 (stir bar sorptive extraction,sbse ),于1999年由比利时sandra教授提出并有德国gerstel公司商品化。特点是：萃取相为1mm厚的高纯聚二甲基硅氧烷(pdms)橡胶管，套于一内封磁芯的玻璃管上，可以很有效地从水基质中萃取有机组分。萃取时吸附搅拌棒自身旋转搅拌样品，避免了在fiberspme中搅拌子表面对样品的竞争吸附。萃取棒的长度为15-30mm, 根据长度的不同萃取相的

20、体积一般为55-250l，分别比fiber spme和in-tube spme萃取固定相体积大50倍以上和5倍以上，因此富集倍数相应提高。,53,搅拌棒式吸附萃取 (stir bar sorptive extraction,sbse ),54,sbse主要特点,相对于fiber spme 优点： （1）较高的富集倍数，适合于痕量物质的分析。 sbse萃取相体积一般大于50l，而fiber spme为0.5l. (2）萃取效率和重复性好 sbse在萃取过程中自身搅拌，避免了fiber spme萃取过程中搅拌子表面的竞争吸附。此现象对于非极性的多环芳烃(pah)及多氯联苯(pcb)类物质尤为明显。

21、,55,sbse主要特点,缺点： (1) 与气相色谱联用时需用特制的解析器 fiber spme：热解析在gc进样器内完成；sbse是需用匹配的热解器 （2) 萃取平衡时间长（20倍于spme） （3）萃取相制备困难,56,gerstel热解析器tds2示意图和实物图,57,58,相同的条件下萃取搅拌棒(a)和萃取纤维针(b)萃取多环芳烃类样品色谱图,59,类别 单滴液相微萃取技术 single drop-based liquid phase microextraction, sdme 中空纤维液相微萃取技术 膜萃取 membrane microextraction, mme,液相微萃取技术,

22、基本原理：液液萃取 优点：操作简便、快捷、成本低廉、易与色谱系统联用,60,单滴液相微萃取技术（sdme）,1996年由jeannot等首次提出 特征：由悬挂的单滴与水不互溶的有机相溶剂作为吸附剂，实现 对水相体系中非极性样品的选择性富集和浓缩。 特点： 结构简单、易于推广和操作、可选择有机相余地大 悬滴容易脱落或发生损失、重现性差,61,单滴液相微萃取,62,sdme as an on-line preconcentration method in capillary electrophoresis,figure 2. electropherograms of (a) 3 nm fitc (

23、1) and fluorescein (2) in a 20 mm sodium borate buffer and (b) 30 pm fitc and fluorescein enriched by 15-min lpme from a 1-ml sample solution at 35 c using a 2-nl octanol layer. ce run buffer: 20 mm sodium borate (ph 9.5). capillary: 50 cm (effective length 44 cm) 75 m i.d. gravity injection for 5 s

24、 at 12 cm. separation voltage: 10 kv. fluorescence detection at 543 nm,63,中空纤维液相微萃取技术( hf-lpme),hf-lpme于1999年由pedersen等首次提出,特征：以多孔的中空纤维为微萃取溶剂（接收相）的载体， 特点：集采样、萃取和浓缩于一体。 该技术装置简单（一般只需一支微量进样针、小段多孔中空纤维和样品瓶）， 具有成本低，易与gc、hplc、ce联用等优点；同时微萃取是通过有机溶剂在 纤维壁孔中形成的液膜进行传质，在多孔的中空纤维腔中进行萃取，并不与 样品溶液直接接触，从而避免了sd-lpme溶剂容易

25、损失的缺点；由于大分子、 颗粒杂质等不能通过纤维壁孔，因此还具有spme、sdme不具备的突出的样 品净化功能;环境友好的样品前处理新技术 所需有机溶剂很少（几至几十微升) 在痕量、超痕量有机污染物分析领域具有广阔的应用前景.,64,纤维的两端接在两根不锈钢 针上，一根负责注入溶剂，另一根 负责接受溶剂，接受的溶剂可直接 用于色谱和电泳分析。 萃取效果较好，但操作繁琐,hf-lpme装置,先用进样注射器把接受溶剂推入纤维腔 在把纤维浸到萃取溶剂中，使其充满纤维孔 萃取溶剂吸入注射器，弃去纤维，直接进样分析,65,中空纤维液相微萃取技术( hb-lpme),66,hf-lpme原理性示意图-1,

26、液液两相微萃取 纤维孔中的溶剂与纤维腔中的溶剂相同 原理和一般的萃取相同 适用于在有机相中溶解度较高的样品,样品溶液,相同有机溶剂,中空纤维,67,、,纤维腔中与纤维孔中的溶剂类型不同，而形成液液液三相体系 仅适用于能离子化的酸碱样品 调节样品的ph值，降低在样品中的溶解度，而增加在受体溶液中的溶解度,样品溶液,不同类型的溶剂,中空纤维,hf-lpme原理性示意图,68,hflpme在药物分析中的应用,多数药物在有机相和样品中的分配系数较低，故多采用三相萃取模式 目前报道的应用分析有：体液中的苯并胺、萘普生、吗啡、美沙酮、布洛芬以及西米替丁等 富集倍数可达几十到一百倍，检出限在ng/ml的水平

27、,69,总结与展望,成本低、装置简单、样品净化功能强、不存在交叉污染、多种模式下操作 可以和gc、hplc、ce等分析仪器联用 灵敏度和重现性略显不足,70,加速溶剂萃取 accelerated solvent extraction (ase),1995年由richter等人首次提出 基本原理：利用物质溶解度和溶质扩散效率在高温高压下增加的原理实现萃取效率的提高，从而减少溶剂消耗。 适用对象：固体或半固体样品,萃取过程用液体溶剂和溶质基体 温度：40-200c；压力：1500-2000 psi 溶剂用量、分析时间 10克样品用15 ml、15 min ase在很多方面可完全替代索氏，超声波，加

28、热，振摇和其它传统萃取方法,71,加速溶剂萃取 accelerated solvent extraction (ase),在高温高压下进行溶剂萃取的优势： 提高分析物的溶解能力 降低溶剂粘度，使溶剂分子更易进入样品基质 提高分子运动的能力，使分析物更 易挣脱基质的束缚 提高分散能力，使分析物更易扩散 人溶剂中 增加压力使溶剂在萃取过程中一直保 持液态,72,ase优势,缩短萃取时间 传统索氏萃取：4-48 h，自动索氏萃取：1-4 h 超临界流体萃取、微波萃取：0.5-1h; ase, 12-20 min 减少溶剂用量 传统索氏萃取：200-500 ml; 自动索氏萃取：50-100 ml;

29、超临界流体萃取, 150-200 ml; 微波萃取, 25-50 ml; ase, 15 ml 提高萃取效率 温度、压力增加，基质影响减少,73,溶剂萃取技术的比较,74,溶剂,泵,清洗阀,炉,氮气,静态阀,收集瓶,萃取池,ase示意图,75,ase提高温度的作用,增加解吸动力学 减少溶剂的粘度 被测物扩散进入溶剂更快 克服基体效应 增加被测物溶解度 用更少的溶剂和时间! 范围从40c-200c,温度从25增至150 时，溶剂的扩散系数可提高2-10倍,76,ase提高压力的作用,迫使溶剂进入在低压下受阻的孔隙中 加压使高温下溶剂操持液态 样品池在高压下快速充满 典型值: 1200-2500

30、psi (3000 psi 最大值）,77,ase产品,单一池和瓶操作 样品池的尺寸为10, 34, 66, 和100 ml,dionex ase 100,78,ase产品,dionex ase 200,含24个样品池的自动萃取 样品池体积大小为1, 5 11, 22, and 33 ml 典型的萃取时间为每个样品15 min 萃取溶剂体积为550 ml,样品前处理的更快速, 更有效,79,ase产品,dionex ase 300,对于大体积样品是理想的方法,12个样品池的自动萃取 样品池体积大小分别为34, 66, 和100 ml 典型的萃取时间为一个样品15 min 萃取溶剂体积为4015

31、0 ml,80,ase产品北京吉天仪器有限公司,压力范围：大气压20mpa 炉体最高到200 萃取池体积：11ml、22ml、33ml 24个样品位 萃取时间：8min20min,81,ase的应用领域,12566,ase目前 已遍及世界上1100个实验室,82,用不同溶剂对同一种烟叶进行萃取的结果,83,微波萃取 microwave assistanted extraction (mae),1986年由r.ngedye 等首次提出 利用普通家用微波炉里通过选择功率档、作用时间和溶剂类型，短短 几分钟就可萃取传统加热需要几个小时甚至十几个小时的目标物质。 1987年， gangler 曾从棉籽

32、中提取棉实糖，从豆类中提取豆碱。 1990初，加拿大环境保护部cwt-tra n 公司 携手开发了微波 萃取系统 microwave assisted process 简称 map），现已广泛应用到香料、 调味品、天然色素、中草药、化妆品和土壤分析等领域，并于1992年 开始陆 续取得了美国、墨西哥、日本、西欧、韩国的专利许可，并用大生产线在 薄荷、海藻中提取有效物质均获得成功。,84,微波萃取 microwave assisted extraction (mae),原理： 一方面高频电磁波穿透萃取介质到达物料的内部。由于吸收微波能物料内部温度 迅速上升，使其细胞迅速细胞破裂，在较低的温度条件

33、下萃取介质捕获并溶解； 另一方面，电磁场加速被萃取部分成分向萃取溶剂界面扩散速率，用水作溶剂时， 在微波场下，水分子高速转动成为激发态，这是一种高能量不稳定状态，或者 水分子汽化，加强萃取组分的驱动力；或者水分子本身释放能量回到基态， 所释放的能量传递给其他物质分子，加速其热运动，缩短萃取组分的分子由 物料内部扩散到萃取溶剂界面的时间，从而使萃取速率提高数倍，同时还降 低了萃取温度，最大限度保证萃取的质量,85,微波萃取的优点,传统热萃取是以热传导、热辐射等方式由外向里进行，而微波萃取是通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热。传统热萃取和传统热萃取相比，微波萃取具有以下特点： 、快速、高