课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (6)

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数,专题二 微生物的培养与应用,课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。但是尿素不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因：,脲酶,能合成 。,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,

2、原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,怎样配置能筛选分解尿素的细菌的培养基呢？,观看实验过程，然后完成导学案,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,选择培养基,4、

3、培养基选择分解尿素的微生物的原理,选择培养基：,？,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,1.稀释涂布平板法（活菌计数法）,每克样品中的菌落数(CV)M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)， M代表稀释倍数。,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,原理：,.统计菌落数目：,方法有哪些？,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度涂布到

4、三个或三个以上的平板中，培养并计算出菌落平均数。 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。,为什么？,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A结果误差过大，不应用于计算平均值,讨论,2、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计

5、算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌；,缺点,设置对照的主要目的：,.设置对照：,A同学出现该结果的原因及实验验证,是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,讨论：,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案二：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案一：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照。,1.使用选择培养基的目的是（ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2

6、和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,习题巩固,C,D,二.实验设计 .土壤取样 .制备培养基：,对照组,实验组,导学案,分离不同的微生物采用不同的稀释度,（三）样品的稀释与涂布,原因： 目的：,保证获得菌落数在30300之间.,不同微生物在土壤中含量不同,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔 统计一次菌落数目。 选取 时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,（五）、细菌的计数,当菌落数目稳定时，

7、选取菌落数在_的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求_，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,三、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,（导学案）,四.结果分析与评价,（导学案）,无,偏高,其他氮源,大于,30300之间,接近,五.课题延伸,思考：能在以尿素为唯一氮源的培养基中生存的细菌一定是能分解尿素的细菌吗？,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂_，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。,大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,本课题知识小结:,1.下列

8、说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。 2.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,3生物选修1：生物技术实践（15分）（2014年全国2卷） 为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含

9、量，并进行了细菌的分离等工作。回答下列问题： （1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是 ；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为 。 （2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过 灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是 。 （3）示意图A和B中， 表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。 （4）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液的 的含量，同时可以使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。,检测培养基平板灭菌是否合格,3.8107,灼烧,将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落,B,溶解氧,营养物质,设置对照的主要目的：,