生物光子学5-04

1、主讲人：刘立新 西安电子科技大学,生物光子学,1,第 5 章,生物光子学成像技术,2,5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,本 章 内 容,3,荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET） 工作原理： 一对合适的荧光物质（可以是不同分子或同一分子的不同生色

2、团）可以构成一个能量供体(donor) 和能量受体(acceptor) 对，它们之间由于偶极-偶极的相互作用，激发供体分子的光子能量h能够被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子h(h h) 而松弛，这个过程就是荧光共振能量转移。 以供体的激发光激发，供体产生的荧光强度比它单独存在时要低得多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随供体的荧光寿命的相应缩短和受体的荧光寿命的相应拉长。,5.7 荧光共振能量转移成像技术,4,FRET发生条件： 1）供体和受体之间达到合适的距离内(110 nm)，能量转移效率和分子之间距离的六次方成反比关系； 2）供体与受体的跃迁偶极有一定的相对取向； 3）供体的

3、发射光谱与受体的吸收光谱有相当程度的重叠。 FRET成像是生物医学研究的重要手段之一。它应用于蛋白质-蛋白质间相互作用，钙新陈代谢、蛋白酶活性、和高吞吐量放映化验等研究。,5.7 荧光共振能量转移成像技术,5,CFP/YFP FRET能级图,5.7 荧光共振能量转移成像技术,CFP受光激发后便发射光； CFP离YFP的距离大于10nm； YFP没有受到激发，因此也不发射光。,CFP受光激发后但没有发射光； CFP与YFP的距离非常接近（1-10nm）； YFP没有受到激发，但发射光。,6,5.7 荧光共振能量转移成像技术,7,已知的FRET对： 染料类：FITC/Rhodamine、Alexa

4、488/Cy3、Cy3/Cy5、FITC/Cy3 荧光蛋白类：CFP/YFP、BFP/GFP、BFP/YFP、CFP/DsRED、GFP/DsRED 混用：GFP/Rhodamine,7,5.7 荧光共振能量转移成像技术,8,8,5.7 荧光共振能量转移成像技术,9,9,10,FLIM-FRET,From: Phizicky E, Bastiaens PIH, Zhu H, Snyder M, Fields S. “Protein analysis on a proteomic scale”, Nature, 422, 208-215,2003,Figure 3:Principle of op

5、tical detection of protein post-translational modifications on a cell microarray,10,FRET目前应用的几个热点： FRET技术及其应用向亚细胞及单分子观测水平发展 信号转导通道（网络）的亚细胞水平定位 生理事件过程中信号转导过程的细节、以及调控过程的时空关系 利用FRET技术追踪在体水平生命过程,5.7 荧光共振能量转移成像技术,11,11,5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振

6、能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,本 章 内 容,12,荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发态平均停留的时间，定义为荧光强度衰减到初始值的1 / e (37% ) 时所需要的时间，通常小于100ns 。 通过扫描测量样品不同位置处的荧光寿命成像，能够反映组织微环境，如分子所处微环境中的许多生物物理、生物化学参数如pH 值、离子浓度(如Ca+ 、K+等) 、氧压、溶液疏水性及猝灭剂(如碘化物、丙烯酰胺) 等的分布。,5.8 荧光寿命成像显微技术,Exponential

7、decay of fluorescence,13,荧光寿命成像显微技术（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM）的特点： 荧光寿命对荧光分子局部环境高度敏感； 荧光寿命不受荧光强度、染料浓度的影响，并且最大程度上与荧光剂的光致漂白无关； 尽管某些荧光团的荧光谱相似，但在不同的环境下其寿命不同，因此寿命是更加敏感的环境参量； 由于供体能量转移到受体上，因此只需要测量供体的荧光寿命，就可以测量其能量转移（FRET）。,5.8 荧光寿命成像显微技术,14,14,Photochem Photobiol Sci 4, 13-22, 2005,利用荧光

8、寿命能够测量,折射率，pH，Ca2+浓度等,长寿命-无 FRET 短寿命-有FRET,分子的旋转动力学,5.8 荧光寿命成像显微技术,15,15,5.8 荧光寿命成像显微技术,16,16,外部因素则包含多方面，主要有： 光照射是致荧光淬灭的最常见原因，； 荧光物质的分子与外部分子(或离子)形成非荧光的化合物； 共振能量的转移； 溶剂种类、pH值及温度等环境条件。,荧光淬灭是指荧光分子由内部因素和外部因素同时作用造成的不可逆破坏。内部因素主要是分子从激发态回到基态以非辐射跃迁形式释放能量。,Quenching & Bleaching,Philippe I. H. Bastiaens and An

9、thony Squire. trends in CELL BIOLOGY (Vol. 9) February 1999,= (m+ p )/ 2 p= phase of fluorescence m=modulation depth of fluorescence,荧光寿命测量：时域和频域,5.8 荧光寿命成像显微技术,17,17,FLIM实现方法,= (m+ )/ 2 = phase of fluorescence m=modulation depth of fluorescence,5.8 荧光寿命成像显微技术,调制激发和发射光的直流成分分别为A和B；调制振幅分别为a和b；发射光相对于激发

10、光的相位延迟为，解调系数为M。,相位寿命：,调制寿命：,调制频率f， =2f,5.8 荧光寿命成像显微技术,频域法测量荧光寿命原理图,= (M+ )/ 2,19,荧光寿命的时域测量方法： 门控像增强器（Gated image intensifier ） 时间相关单光子计数器（ Time Correlated Single Photon Counting，TCSPC） 扫描相机（Streak camera）,5.8 荧光寿命成像显微技术,20,20,Gated image intensifier,基于门控像增强器的FLIM,5.8 荧光寿命成像显微技术,21,21,from W.Becker著，

11、屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，2009,TCSPC测量寿命,5.8 荧光寿命成像显微技术,22,22,TCSPC Principle,from W.Becker著，屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，2009,5.8 荧光寿命成像显微技术,23,23,5.8 荧光寿命成像显微技术,24,时间相关单光子计数法装置示意图,24,Sample,TCSPC Card,Fluorescence Decay Analysis,Ti:Sapphire Laser,Dichroic,Fluorescence Lifetime Image,Emission Filter,Det

12、ection MCP-PMT,Scanner,Leica TCS SP2,Becker & Hickl SPC 150,利用TCSPC技术的共焦FLIM技术,5.8 荧光寿命成像显微技术,25,25,深大光电工程学院TCSPC-FLIM系统,5.8 荧光寿命成像显微技术,26,26,扫描相机工作原理,5.8 荧光寿命成像显微技术,27,27,基于扫描相机的FLIM: Streak-FLIM of Hamamatsu,FLIM optics,Streak Camera,5.8 荧光寿命成像显微技术,28,28,基于扫描相机的FLIM: STSR-MMM,5.8 荧光寿命成像显微技术,29,29,

13、基于扫描相机的FLIM: STSR-MMM of SZU,Scan optics,Streak camera,5.8 荧光寿命成像显微技术,30,30,用双光子FLIM测量氯离子浓度,FLIM的应用,5.8 荧光寿命成像显微技术,31,31,FLIM的应用-区分有相互作用和没有相互作用的蛋白分子,5.8 荧光寿命成像显微技术,32,32,FLIM的应用-研究蛋白分子之间的相互作用,5.8 荧光寿命成像显微技术,33,33,FLIM的应用-测量组织中的pH,5.8 荧光寿命成像显微技术,34,34,FLIM的应用-AMD的检测及诊断,5.8 荧光寿命成像显微技术,35,35,5.1 光学成像 5

14、.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,本 章 内 容,36,医学成像回顾,5.9 光学相干层析成像技术,37,37,进入20世纪90年代，由于医学对无辐射损伤、高分辨率层析成像的需求，光学相干层析成像技术（OCT，Optical Coherence Tomography）孕育而生，并逐渐成为该领域的研究热点。 OCT是继超声、X射线、核

15、磁共振等层析成像技术之后，又一种新型的层析成像技术。 OCT将激光技术、超灵敏光电探测、精密自动控制和计算机图像处理等多项技术综合为一体。 OCT作为一种全新的光学层析成像技术，以其无辐射、非侵入、高分辨率及高探测灵敏度等特点，在临床医学领域具有巨大的发展前景。,5.9 光学相干层析成像技术,38,1991年，美国的麻省理工学院的J. G. Fujimoto和D. Huang等人成功地开发了光学相干层析成像技术，该技术结合了共焦显微术和低相干光的外差探测技术，通过快速扫描实现二维或三维层析成像。,5.9 光学相干层析成像技术,39,OCT（Optical Coherence Tomograph

16、y)：一种类似于超声成像的反射成像技术，用光波代替声波，利用组织内部结构的散射光成像。 原理：如果散射点的后向反射光和参考光出于同一光源，若光程差在相干长度范围内，就会产生一个特定的相干图样。 适合于高散射组织，例如硬组织,5.9 光学相干层析成像技术,40,40,5.9 光学相干层析成像技术,41,41,Axial Scanning (Depth),Backscattering Intensity,Cross-sectional imaging,5.9 光学相干层析成像技术,42,42,迈克尔逊干涉仪,5.9 光学相干层析成像技术,OCT 技术的核心是迈克尔逊干涉仪，利用光源的低相干特性，当

17、参考臂和样品臂的光程匹配时（光程差在一个相干长度范围内），产生干涉条纹。,相干光和低相干光干涉光强图,43,a、两臂光程差光源相干长度时，才有干涉条纹输出； b、通过测量背向散射光来反映组织内部折射率的非连续性变化，条纹强度正比于后向散射光强度；,5.9 光学相干层析成像技术,44,OCT原理：是利用Michelson干涉原理，结合光学外差探测技术对样品的弱反（散）射光信号进行探测，利用傅立叶变换原理重构样品结构。,44,OCT的空间分辨率,d为在物镜处的光斑直径，x为焦点处光斑直径，f为聚焦物镜焦长。,5.9 光学相干层析成像技术,45,d、横向分辨率由聚焦光斑大小决定；,e、成像深度由散射

18、自由程决定，组织中13mm。,c、轴向（深度）分辨率（=光源的相干长度）：,(1 10 m),(2 15 m),45,OCT的空间分辨率,5.9 光学相干层析成像技术,46,46,为克服微弱干涉信号给检测带来的难度，OCT系统通常采用固定频移法来产生外差信号，实现外差探测。,光外差探测技术,光外差探测技术是一种高精度的测量技术，它将包含有被测信息的相干调制光波和作为基准的本机振荡光波，在满足波前匹配条件下在光电探测器上进行光学混频。探测器响应的输出是频率为二光波光频差的拍频信号，该信号包含有被调制信号的振幅、频率和相位特征。,外差探测的灵敏度比直接探测将高107108量级。,1,增益：,5.9

19、 光学相干层析成像技术,47,47,数据采集与处理,在光电探测器输出电信号的处理上，要经过以下几个步骤： 首先要经过带通滤波器将直流和高频光强滤除，只允许外差调制信号通过； 然后再进行信号包络检测（解调：低通或锁相放大）； 最后利用高速数字采集系统将模拟电信号转换成数字信号，并传输到计算机系统进行图像重建和显示。,5.9 光学相干层析成像技术,48,48,光纤式OCT,5.9 光学相干层析成像技术,49,50:50光纤耦合器,光纤OCT的特点: 灵活性 可携带 易于集成到其他医学成像仪器，例如：内窥镜,49,OCT的优势 分辨率高： OCT图像轴向分辨率和横向分辨率互不相关，能提供独立于横向分辨率的近似于微米量级的轴向分辨率。 高灵敏度：由于引入了外差探测，其探测灵敏度远远高于直接探测。典型的OCT系统可达到90dB100dB的探测灵敏度，能够探测来自高散射生物组织23mm深度的光学信号。 实时成像 结构简单、成本低廉： OCT成像装置的核心是迈克尔逊干涉仪，成像原理简单，制造成本相对较低，各种光学器件和检测设备易于在市场中购买。 与导管和内窥镜兼容：基于光纤的设计可以使OCT系统直接和导管或者内窥镜结合起来。 OCT的缺点： 分辨率低于双光子荧光或共聚焦显微镜。,5.9 光学相干层析成像技术,50,50,OCT在医学诊断领域的主要应用,OCT技术在眼科疾病、牙科疾病、心血管