异基因造血干细胞移植的免疫.ppt

1、安徽省立医院输血科 王保龙,异基因造血干细胞移植的免疫 生物学问题及对策,前 言,1952年，Lorenz等最先在小鼠模型中发现，输注骨髓（BM）可治愈致死剂量照射引起的放射病。,前言,进一步研究发现 输注同基因或异基因BM均能救治小鼠放射性发育不全。 但输注异基因BM会出现致死性的并发症，表现为 出汗，腹泻和皮肤损伤即移植物抗宿主病 （GVHD）。,提示BM移植不能用于人类!,前言,1958年： 发现人类组织相容性抗原 研制出免疫抑制剂 为allo-HSCT应用于临床铺平了道路！,前言,60年代，骨髓移植进入临床应用阶段。1964年我国开展第1例同卵孪生姐妹骨髓移植。,前言,80年代以来，造

2、血干细胞移植一直是治疗血液系统恶性疾病的主要手段。,前言,90年代, 造血干细胞的来源多样化 BM 1990年以前，BM是唯一的来源。 动员的外周血（PB） 90年代中期用于临床。 脐血（UCB） 1995年首次报道用于儿童， 2004年首次报道（Lauglin，et al）无关 供者UCB用于成人。目前通常用双份UCB 用于成人。,前言,目前： HLA配型技术的发展 预处理方法的改进 新型免疫抑制剂的应用 移植成功率和长期生存率显著提高 急性白血病缓解期移植35年生存率达50%70% CML为60%85%,前言,移植排斥 GVHD 白血病复发 机会感染 面临的严重问题！,移植排斥或宿主抗移植

3、物反应（HVGR）,发生机制 由受体NK、CD4+T和CD8+T细胞等识别供体异型的组织抗原所介导。 影响干细胞植入，造成移植失败。,移植排斥,自然杀伤细胞（NK） NK表面表达抑制性受体(KIR、KLR），其配体是经典的自身MHC-类分子，两者结合后传导抑制性信号，阻止NK的激活。 由于体内绝大多数细胞都表达MHC-类分子，所以NK对正常自身组织细胞不具攻击作用。,移植排斥,在造血干细胞移植中，同种异体细胞由于缺乏自身MHC-类分子，这些细胞就成为NK攻击的对象。 附： NK表面抑制性和激活性受体 抑制KIR2DL KIR3DL CD94/NKG2A 激活NKG2D,移植排斥,CD4+T细胞

4、 受体初始型CD4+T细胞识别供体细胞主要/次要组织相容性抗原后被激活。 分化成Th1。 Th1细胞是移植排斥主要的效应细胞 通过释放多种炎症性细胞因子和趋化因子，诱发迟发型超敏反应，导致移植排斥。,移植排斥,CD8+T细胞 受体初始型CD8+T细胞识别供体细胞主要/次要组织相容性抗原后被激活。 分化成CTL。 通过分泌穿孔素、颗粒酶裂解供体细胞。 通过Fas/FasL途径诱导供体细胞凋亡。,移植排斥,诱发因素 供、受体间主要组织相容性抗原不合 供、受体间次要组织相容性抗原(MiHA)不合 KIR不合 NK途径,移植排斥,对策 供体的选择 HLA相合 性别(雌性可能排斥雄性) MiHA相合（分

5、子水平进行MiHA配型） 对受体进行预处理 清髓性预处理 大剂量细胞毒性药物+全身放疗，常用TBI+CY 减低强度预处理 低剂量细胞毒性药物+免疫抑制剂，BU+CY,移植排斥,清髓处理的、HLA相合的同胞供体（MSD） 移植，HVGR罕见。 主要发生在 ： HLA不相合的同胞供体（USD）移植 HLA相合的无关供体（MUD ）移植,移植排斥,评价指标 植活指标 WBC1109/L 中性粒细胞0.5109/L 血小板20109/L 供体细胞嵌合率（DC） ph染色体丢失 血型转化,移植排斥,不同移植造血重建时间 中华内科杂志,2007,46(2):135-139,HLA-A、B、DR血清学全相合

6、。RD-HSCT组高分辨率基因配型全相合58例， URD-HSCT组47例,GVHD 概述,定义 移植物中供体T细胞识别受体（处于免疫缺陷状态）组织抗原，发挥效应功能而引起的炎症性疾病。,GVHD概述,GVHD发病条件 供、受体间主要/次要组织抗原不合 受体免疫缺陷，不能引起足够的排斥 移植物中含有免疫活性细胞,GVHD概述,GVHD分类 急性 GVHD（aGVHD） 慢性 GVHD（cGVHD） GVHD引起的死亡占allo-HSCT总死亡的 15%,急性GVHD概述,aGVHD是异基因HSCT重要的死亡原因 ，HLA相合的同胞移植，其发病率仍高达30%60%。 通常发生在移植后100天以前

7、，病理损伤由Th1细胞介导，伴有B细胞数量减少。 临床表现为炎症性疾病，病理表现为组织坏死和细胞凋亡。 受累组织主要是皮肤、肠道、肝、肺、胸腺。,急性GVHD,受体残存APC激活 供体T细胞激活 效应阶段,发病机制 图5,图5 急性 GVHD发生机制,急性 GVHDaGVHD的预防策略,控制LPS和内毒素的产生释放 保护肠粘膜（G1管）免受损伤 用中和抗体封闭细胞因子,阻断受体APC激活,急性 GVHD aGVHD的预防策略,控制LPS和内毒素的产生释放 移植前抗生素（非吸收）治疗肠腔去污染；(动物模型有效, 多中心应用部分有效),急性 GVHDaGVHD的预防策略,保护肠粘膜（G1管）免受损

8、伤 KGF、IL-11、肝细胞生长因子注射(动物模型有效，但IL-11在/临床中显示无效),急性 GVHDaGVHD的预防策略,用中和抗体封闭细胞因子 封闭IL-1受体、阻断TNF-a在动物模型中具有预防GVHD的作用，但大样本临床观察显示无效。,急性 GVHDaGVHD的预防策略,阻断T细胞激活 免疫抑制剂抑制T细胞激活 生物制剂体内清除T细胞 生物制剂阻断共刺激信号 体外删除移植物中供体T细胞,急性 GVHD aGVHD的预防策略,免疫抑制剂抑制T细胞激活 CsA +MTX FK506+MTX CsA +MMF 在非血缘移植，预防疗效低于 CsA +MTX 雷帕霉素+FK506 重度黏膜炎

9、发生率下降，住院时间缩短，但血栓性微血管病变发生率增高。,急性 GVHDaGVHD的预防策略,生物制剂体内去除T细胞 OKT3 副作用大，感染发生率高，目前应用较少。 ATG/ALG 主要用于非血缘移植、单倍型移植和RIC。临床资料显示：在预处理阶段后期应用ATG显著降低急慢性GVHD的发生率。但免疫重建延迟，感染增加。 抗CD52单克隆抗体 GVHD发生率显著CMV感染率,急性 GVHDaGVHD的预防策略,生物制剂阻断共刺激信号 CTLA4-Ig和抗CD40L单抗 期临床显示良好的效果。,急性 GVHD aGVHD的预防策略,体外删除移植物中供体T细胞 非选择性删除移植物中供体T细胞 选择

10、性删除异体反应性T细胞,急性 GVHD aGVHD的预防策略,非选择性删除移植物中供体T细胞 Anti-CD3 单抗 MACs分选 降低GVHD效果明显，但影响植入， 肿瘤复发和感染增加！,急性 GVHD aGVHD的预防策略,非选择性删除移植物中供体T细胞 Anti-CD3 单抗 MACs分选 降低GVHD效果明显，但影响植入， 肿瘤复发和感染增加！,选择性删除异体反应性T细胞 删除异体反应性CD25+T细胞 删除异体反应性CD69+T细胞 光促反应清除异体反应性T细胞,急性 GVHD aGVHD的预防策略,急性 GVHD aGVHD的预防策略,体外删除异体反应性CD25+T细胞 供体单个核

11、细胞+照光的受体T细胞（IFN-r预刺激）,MLC,MACS删除CD25+T细胞,剩余部分输给受体,期临床：16例单倍型移植（未用免疫抑制剂）无1例发生严重GVHD,缺陷： 删除 CD4+ CD25+ 调节性 T细胞！,供体T细胞中针对受体组织抗原特异性的T细胞克隆被激活表达CD25,急性 GVHDaGVHD的预防策略,选择性删除异体反应性CD69+T细胞 方法同上 小鼠模型 生存率提高71.4% 至今尚无保护抗白血病效应的报道 光促反应清除异体反应性T细胞 方法同上 TH9402,（514 nm可见照射） 小鼠模型证明有效,阻断效应功能,急性 GVHD,aGVHD的预防策略,Anti-Fas

12、L 中和抗体，Fas-IgFc阻断Fas- FasL通路； 莫夫利单抗（infliximab）阻断TNF-a。,急性 GVHD aGVHD的治疗,出现度GVHD是治疗的指征之一，但需结合 GVHD的高危因素和复发的危险因素综合考虑。 除基础免疫抑制剂CsA 或 FK506外，皮质激素目前 仍是一线治疗药物。 对于MSD，皮质激素大约可使40%50%患者获得 持久的疗效。而MUD有效率不到30%。,急性 GVHD aGVHD的治疗,皮质激素耐药者： ATG 、CD25单抗、TNF-a单抗是二线药物。 ATG总有效率20%60%，长期生存率无改善，1年死亡率高达90%（感染引起）。 CD25单抗疗

13、效优于ATG，对急性GVHD有效率达47%68%，但亦导致感染增加，长期生存率约为29%-50%。 TNF-a单抗单独或与CD25单抗联合应用，对难治性急性GVHD有效率为65%左右，但感染发生率高达50%80%，长期生存率仅为38%。,急性 GVHD aGVHD的治疗,总之aGVHD一旦发生，预后不容乐观。皮质激素有效者长期生存率仅为50%60%，耐药者长期生存率只有5%30%。 目前尚无任何一种治疗措施能有效改善皮质激素耐药者长期生存率。 降低GVHD相关死亡率的关键是有效的预防，即预防优于治疗。,慢性GVHD概述,cGVHD是异基因HSCT后期最重要的死亡原因和最常见的并发症。 生存超过

14、100天的患者，cGVHD的发病率约为20%70%。 70%80%的cGVHD是由aGVHD (-) 发展而来。,慢性GVHD概述,cGVHD病理反应以Th2型免疫应答为主，有自身抗体产生。 临床表现类似于胶原性疾病，病理表现为炎症和纤维化。 受累器官以皮肤、粘膜和外分泌腺为主。,慢性GVHD,预处理 aGVHD 年龄相关的胸腺萎缩 自身反应性T细胞逃逸胸腺阴性选择，进入外周。 自身反应性T细胞通过直接的细胞毒性作用或辅助B细胞产生自身抗体引起 cGVHD 。见图6,发病机制,胸腺 功能 下降,图6 cGVHD的发生机制,慢性GVHD预防策略,选择合适的供者 预防aGVHD,慢性GVHD预防策

15、略,选择合适的供者 选择主要/次要组织抗原相合 选择ABO相合 CMV（-） 性别 年青供者,慢性GVHD预防策略,预防aGVHD 皮质激素预防aGVHD增加cGVHD的发病率(2篇文献) 清除受体APC NK细胞破坏受体APC KIR不合的移植CGVHD的发病 率下降、复发率下降 体外光免疫学疗法（ECP）清除受体APC 明显降低CGVHD的发病率（Chen et al）,慢性GVHD治疗策略,免疫抑制剂治疗 抗OX40治疗 Treg治疗 间充质干细胞（MSC）治疗 细胞因子治疗,慢性GVHD治疗策略,免疫抑制剂治疗抑制致病性T细胞 皮质激素是最常用的治疗药物 其他药物 羟氯喹 期临床表明,

16、对53%皮质激素抵抗的cGVHD 有反应 MMF+CsA/FK506 难治性CGVHD有效率50% 腺苷脱氨酶抑制剂 效果良好,长期免疫抑制剂治疗（13年)继发性肿瘤发生率和机会感染增高!,慢性GVHD治疗策略,抗OX40治疗 文献报道，表达OX40(CD134)的CD4+T细胞与CGVHD的发病有关。 OX40可能是CGVHD致病性T细胞的表面标志。 OX40L单抗治疗在小鼠模型中显示有效，人未见报道。,慢性GVHD治疗策略,Treg治疗 调节性T细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞，目前最受关注的是CD4+CD25+Treg。,Treg亚群,慢性GVHD治疗策略,CD4+CD25+Treg

17、治疗 大量文献报道，从移植物中去除CD4+CD25+Treg加速GVHD发生，而移植同时加入新鲜分离的CD4+CD25+Treg则显著延缓甚至预防GVHD。,慢性GVHD治疗策略,CD4+CD25+Treg治疗 在鼠模型中，新鲜分离的或扩增的CD4+CD25HighTreg能够改善GVHD，而仍然保留GVL反应。 CD4+CD25+Treg治疗可作为一种新的控制GVHD的有效手段！,慢性GVHD治疗策略,间充质干细胞（MSC）治疗 MSC具有定向分化能力。能向软骨组织、脂肪组织、心肌组织和神经组织等分化。 MSC表面表达中等量的MHC-类分子，但不表达B7、CD40、CD34等分子，不能激活T

18、细胞。 移植异基因MSC后很长时间都可以测到，表明机体免疫系统不能识别和清除MSC。,慢性GVHD治疗策略,间充质干细胞（MSC）治疗 MSC具有免疫抑制作用。 在HLA不合的个体之间移植MSC不仅不需要宿主 免疫抑制，还能够预防GVHD发生。 已有第三者半相合的MSC用于治疗GVHD的报道。,图7 MSC免疫抑制机制,慢性GVHD治疗策略,细胞因子治疗 主要的调节性细胞因子 G-CSF, KGF IFN- IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 IL-12, IL-13, IL-15 , IL-18,慢性GVHD治疗策略,细胞因子治疗 allo-PBSCT患者发生GVHD时细胞因子及

19、转录本结果 IL-4 mRNA及浓度 Nor/-GVHD IL-10 mRNA及浓度 IL-12 mRNA及浓度 IL-18 浓度 ,慢性GVHD治疗策略,细胞因子治疗 细胞因子多态性与CGVHD 供、受体IL-10多态性与CGVHD密切相关 IL-1多态性与CGVHD密切相关 IL-1R多态性与CGVHD密切相关,慢性GVHD治疗策略,细胞因子治疗 IL-2、IL-12、 IL-11、KGF（角质形成细胞生长因子） 和G-CSF 有降低GVHD 、保留GVL的作用。,移植物抗白血病(GVL)概述,白血病复发与GVL效应有关。 移植物中，供体T细胞、NK细胞对受体白血病细胞的杀伤作用称为GVL

20、。,移植物抗白血病概述,GVL与GVHD关联，抑制GVHD会损失GVL、引起肿瘤复发。 根据国际外周血和骨髓移植登记中心（CIBMTR）的资料: 白血病复发引起的死亡,排在干细胞移植的第一位 在MSD中占38%, MUD中占32%。,移植物抗白血病发生机制,受体APC递呈白血病相关抗原，激活细胞和NK细胞。 激活后发挥效应功能杀伤白血病细胞。 在G-CSF动员的PB移植中还有NKT参与。,移植物抗白血病发生机制,GVL相关的抗原 白血病细胞广泛表达的次要组织相容性抗原 白血病细胞特异性抗原（ BCR-ABL ） 白血病细胞过度表达的自身蛋白（蛋白酶3和Wilms tumor 1),图8 GVL

21、发生机制,移植物抗白血病(GVL) 促进GVL的策略,选择性删除异体反应性供体T细胞，减少GVHD、保留GVL 注射IL-7、IL-11和KGF等保护胸腺内皮细胞，增强胸腺T细胞再生输出功能 控制免疫抑制剂应用 DLI,免疫重建定义,移植后，受体免疫功能处于严重的缺陷状态，需要进行恢复，否则就会因机会感染而死亡。 受体免疫系统恢复的过程就叫免疫重建。,免疫重建受体免疫缺陷的相关因素,预处理引起患者淋巴细胞严重缺乏 移植后预防GVHD免疫抑制剂的应用 移植物T细胞删除 GVHD对胸腺功能的损害,造成患者免疫功能严重缺陷和机会感染,机会感染是移植后主要的死亡原因之一,免疫重建感染,随着预防措施的加

22、强、高效抗生素的应用, HSCT后感染发生率及死亡率有所下降。 半相合和无关供体移植的开展、高强度免疫抑制剂的应用、新的耐药菌的出现，移植后感染的预防和治疗仍是难题。 据统计，MSD 和MUD移植后的死亡中，感染分别占17%和21%。,免疫重建感染,G-CSF动员PB移植，早期与中性粒细胞减少有关的感染显著降低。 移植后期，CMV、EBV及真菌感染（以曲霉菌属和念珠菌属为主）显著增加。,免疫重建感染,流行病学 细菌感染 可发生在HSCT后的任一时期，早期(移植后1030天) 因中性粒细胞缺乏，最易发生细菌感染。 国外报道，HSCT后的菌血症主要由革兰氏阳性菌感染引起，占65%75%。 Orte

23、ga等对796例HSCT患者血标本培养分析，发现：G+占63%，G-占29%，厌氧菌占4%。,免疫重建感染,流行病学 细菌感染 我国HSCT细菌感染以G-菌为主，G+菌比例有上升趋势 预防 隔离与无菌护理 药物预防 SMZco、喹诺酮类(环丙沙星、左氟氧沙星) 治疗 寻找病原学依据 及时对症治疗,免疫重建感染,流行病学 真菌感染 近年有上升趋势，最常见的是曲霉菌属和念珠菌属，占真菌感染的90%以上。 预防性药物 伊曲康唑 氟康唑 治疗 侵袭性曲霉菌感染病死率大于90%，早期治疗是关键。二性霉素B是首选药物，伊曲康唑静脉注射与前者等效。 念珠菌 氟康唑是常用药物。,免疫重建感染,流行病学 病毒感

24、染 HSCT后各个时期均可出现，以 CMV、EBV、HSV、腺病毒、水痘-带状疱疹病毒感染较多见。 CMV感染与间质性肺炎密切相关。 一旦发生病毒感染，出现病毒血症，预后较差。,受体免疫缺陷是感染的原因！,免疫重建 T细胞重建,受体免疫功能恢复和重建关系到干细胞移植的成败。 T细胞恢复是免疫重建的关键。 移植后，受体T细胞主要来源于供体干细胞的分化。 干细胞是在胸腺分化发育成为成熟 T细胞的。,胸腺功能决定T细胞重建的成败,免疫重建 T细胞重建,胸腺在青春期就开始退化，成人胸腺途径再生T细胞能力较弱； 移植前预处理和移植后GVHD对胸腺的损伤导致胸腺T细胞再生能力进一步下降； 如何促进T细胞重建是HSCT面临的难题之一。,免疫重建促进免疫重建策略,移植前注射纤维生长因子7保护胸腺内皮细胞免于预处理损伤 注射IL-7、IL-15、FLT3L 促进外周和胸腺T细胞增殖。有文献报道，促进免疫重建的同时也增强了GVHD。,免疫重建促进免疫重建策略,选择性删除移植物T细胞克隆 删除异体反应性T细胞克隆，保留抗肿瘤和抗感染的T细胞克隆。 接种疫苗 多数异基因HSCT受者需常规重建主动免疫。,疫苗 SCT 受者 自体移植 接种时间(移植后) 破伤风类毒素 全体 全体 6月12月 白喉类毒素 全体 全体 6月12月 脊髓灰质炎疫苗 全体 全体 6月12月 肺炎球菌多糖疫苗 全体 部分 6月1