实验五_质粒提取.ppt

1、质粒DNA的少量提取和检测将有用的目的DNA片段通过重组DNA技术传送到接纳体细胞球进行复制和表达的工具称为运载体。 细菌质粒是重组DNA技术中常用的运载体。 质粒(Plasmid )是染色体外的稳定基因，大小不同于1-200kb，是双链、闭合、环状DNA分子，以超螺旋状态存在于宿主细胞球中。 质粒主要见于细菌、放线菌和真菌细胞，具有自我复制和转录能力，能够使子细胞球保持一定的拷贝数，表达携带遗传信息. 质粒的复制和转录依赖于宿主细胞球查询密码的部分酶催化剂和蛋白质，离开宿主细胞球则不能生存，宿主即使没有它们也可以正常生存(自杀质粒oriR6K/pir，or智能运输系统)。 质粒的存在使宿主具

2、有对抗生素的抗逆性等多馀特性。 产生f质粒(也称为f因子或性质粒)、r质粒(耐药因子)和Col质粒(大肠菌群产生因子)，以及限制酶催化剂和修饰酶催化剂等。 质粒在细胞球内的复制一般包括两种类型：密集控制和松弛控制。的类型。 前者只在细胞周期的某个阶段进行复制，染色体不被复制时，也不能复制。 通常，细胞球内只包含一个或几个质粒分子，例如f因子。 后者的质粒可以在整个细胞周期中随时复制，每个细胞球有很多拷贝，一般像Col E1质粒一样有20个以上。 使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时，细胞球内蛋白质合成、染色体DNA复制、细胞分裂被抑制，紧密型质粒复制停止，但松弛型质粒继续复制，质粒复制数可从原来的20

3、个增加到1000-3000个， 此时质粒DNA的总DNA含量可由原来的2%增加到40-50%利用相同复制系统的不同质粒不能共同存在于同一宿主细胞球，2种质粒一旦导入云同步同一细胞球，在复制和随后分配给子细胞球的过程中就相互竞争，在部分细胞球中由于当细胞球几代生长时，会失去占少数的质粒，因此，在细胞球的后代中只有2种质粒的1种，这一现象被称为质粒的不相容性(Incompatibility )。 但利用不同复制系统的质粒可稳定共存于同一宿主细胞球中。 质粒载体基于天然质粒建构人造的，以适应实验室操作。 与天然质粒相比，质粒载体通常具有包含一个或多个选择性标识牌基因(例如，抗生素抗性基因)和合成人造

4、的的多个受限酶催化剂标识位点的多克隆位点序列(MCS )，以去除不需要的序列的大部分，并且尽可能减少分子量以促进基因工程操作。 理想的爱沙尼亚克朗载体大致需要以下特性： (1)分子量小，多拷贝、松弛控制型；(2)具有多种常用的限制性核酸内切酶单接点；(3)可插入大的外源DNA片段；(4)易于操作的检查表类型。 常用的质粒载体大小一般在1kb到10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和蓝牙脚本(简称PBS )等。 许多质粒载体具有多用途辅助序列，如组织化学方法肉眼鉴定重组爱沙尼亚克朗、产生单链DNA进行序列测定、体外转录外源DNA序列鉴定、片段插入方向鉴定、外源基因大量表达等。 t

5、 7推进器311-327 t 7翻译启动器310 t 7标签代码序列207-239多路复用器(bam hi-xhoi ) 将158-203 histagcodingsequence 140-157 t 7终端26-72 lacicodingsequence 714-1793 pbr 322 origin 3227 blacodingsequence细胞球集中分解采用溶血工作团队可破坏菌体细胞贴壁，十二烷基磺酸纳金属钍(SDS )使胞质膜分裂，当细菌染色体DNA缠绕附着于细胞球东鳞西爪时，由于细菌染色体DNA大于质粒，易受机械力、核酸酶等作用，被切成不同大小的线性碎片。 在强热、酸、碱处理下，细

6、菌的线性染色体DNA发生变性，共价键封闭环状DNA (covalentlyclosedcirculardna，简称cccDNA )两条链不相互分离。 外界条件正常恢复时，线状染色体DNA片段难以恢复，碱法的提取主要利用共价键封闭环状质粒和线性染色质的拓扑分析学差异将其分离，在碱性pH、DNA变性、中性恢复时，线状染色体DNA缺乏准确的恢复性，与其他大分子共沉淀，而质粒DNA 提纯质粒的方法大多采用质粒DNA分子相对较小和共价键闭环两种特性。 在细菌细胞球内，共价键质粒以超螺旋的形式存在。 在提取质粒的过程中，除了产生超螺旋DNA外，还产生其他形式的质粒DNA。 质粒DNA的两个链中，一个链在一

7、个或多个位置断裂时，分子旋转去除链的张力，形成松弛型环状分子，称为开环DNA(Open circular DNA，简称ocDNA )。 当质粒DNA的两条链在同一地方被切断时，形成线性DNA(Linear DNA )。 提取的质粒DNA阳离子电泳时，同一质粒DNA的开环和线状分子的泳动速度相比，螺旋状的泳动速度更快。材料、设备和试剂，一、材料为含有pUC19的E. coli DH5菌株、1.5ml塑料离心管(也称为eppendorf管)、离心管信息帧。 二、设备微量除液器(20l、200l、1000l )、台式高速离心机、恒温振荡摇床、涡旋震荡器、阳离子电泳器、阿加里肌肉平板阳离子电泳装置等。

8、 三、试剂1、LB液体培养基：蛋白胨10 g、酵母精5 g、NaCl 10 g 2、氨西林3 .溶液： 50 mmol/L葡萄糖、50 mmol/L葡萄糖高压灭菌在冰箱里保存了15分钟。 4、溶液：0. 2摩尔/升钠、1 SDS。 5、溶液：定容至5 mol/L KAc 60ml、冰冰乙酸11.5ml、H2O 28.5ml、100ml，进行高压灭菌。 溶液的最终浓度为： K 3mol/L、Ac- 5mol/L。 6. NH4Ac 7.5M 7. 70%无水乙醇8、RNA酶催化剂a母液：将RNA酶催化剂a溶解于10mmol/L TrisCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，制成10m

9、g/ml的蒸发制冷后，用埃潘多夫管1.5ml分批保存于-20中。 9、TE缓冲液： 10 mmo/L TrisCl (pH8.0)、1 mmol/L EDTA (pH8.0)。 高压灭菌后，储藏在4冰箱里。 用于阳离子电泳的试剂： (1) TAE缓冲液(50):(2)上样缓冲液(6):0.25%溴酚蓝，40% (w/v )蔗糖水溶液。实验流程、质粒DNA的提取是将含有pUC18的E.coli单菌落在2ml LB Amp液体培养基中振荡370C、190rpm培养一夜(OD=1.0)，在1.5ml的离心管中提取1.5ml菌液、12000rpm， 将采集离心1min的液体流尽，将100uL预冷的溶液

10、I悬浮在菌体中(需要激烈振动)，加入200uL溶液II (现在使用)，温和地使eppendorf管反转数次，进行150uL预冷，使内含物混合(溶液变得清澈透明) 温和翻转eppendorf管数次，在冰上静置5min质粒DNA的复原性(明显的白色沉淀)中加入一滴三氯甲烷，取出12000rpm、4离心5min的上清，转移到干净的eppendorf管中，加入250ul的NH4AC混合，12000 rppm 4除去离心5min的上清液，转移到干净的eppendorf管中，在20度20min沉淀DNA 12000rpm、4离心10min下小心丢弃上清，打开管口反转到纸上，使所有的液体流出，加入70乙醇1ml使其沉淀一次， 在沉淀的洁净台上风干，将沉淀溶解于20l TE缓冲液(包括pH8.0、20g /ml RNaseA )中2 .提取质粒DNA的过程中除去蛋白质很重要，用苯酚/三氯甲烷除去蛋白质的效果比单独使用苯酚或三氯甲烷好为了尽量去除蛋白质的漂亮地，需要多次提取3 .沉淀的DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置的时间稍长，就可以使DNA沉