chapter 5 功能基因组学的主要研究技术.ppt

1、Chapter 5 功能基因组学主要研究技术,功能基因组学（functional genomics）是利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因的功能。 功能基因组学的研究涉及众多的新技术，包括生物信息学技术、生物芯片技术、转基因和基因敲除技术、酵母双杂交技术、蛋白质组学技术、反义核酸技术等技术。,第一部分 生物芯片技术,一、生物芯片的概念,生物芯片（biochip）是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的

2、表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器（如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术 。,生物芯片,计算机芯片,二、生物芯片技术产生背景,20世纪90年代初开始实施的人类基因组计划（HGP）取得了人们当初意料不到的巨大进展。目前已经测定了10多种微生物以及高等动植物的全基因组序列，海量的基因序列数据正在以前所未有的速度膨胀。 一个现实的科学问题摆到了人们面前： 如何研究如此众多基因在

3、生命过程中所担负的功能？ 如何有效利用如此海量的基因信息揭示人类生老病死的一般规律，并为人类最终战胜各种病魔提供有效武器？ 于是，一项类似于计算机芯片技术的新兴生物高技术生物芯片技术，随着人类基因组研究的进展应运而生了。,三、生物芯片分类,基因芯片（Genechip)。基因芯片是最重要的一种生物芯片，是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大量的基因，使

4、人们准确高效地破译遗传密码。,蛋白芯片（Proteinchip）。蛋白质芯片是可以在一个非常小的几何尺度的表面积上，集成多种蛋白质活性分子（配基）。仅用微量的生物（生理）的采样即可以同时检测和研究不同的分子、生物分子之间的相互作用以及基因功能的表达，获得各种条件下蛋白质组的条件变化，从而可以获得生命活动的规律。,芯片实验室（Lab-on-a-chip）。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品制备、生化反应以及检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和

5、分析等部分集成的生物芯片。例如可以将样品制备和PCR扩增反应同时在一块小小的芯片上完成。,四、基因芯片制作与应用,美国AFFYMETRIX公司的一些产品,1989年的第一张芯片，构建在显微镜镜片上,2002年的全人类基因组芯片，包含33000多个基因位点,Southern 将线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核,受精卵移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后,用PCR及Southern blot检测阳性小鼠。结果共移植717枚注射过的受精卵至29只受体鼠,移卵后产仔67只,阳性4只。阳性鼠分别传代,开始建系。结论通过显微注射的方法成功获得了DSP转基因小鼠。,2、逆转录病毒载体法,逆转录病毒载

6、体法将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。 优点：无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA 的胚胎率高。 缺点：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有一定的大小限度；转基因的表达问题尚未解决。,逆转录病毒介导法制备转基因鸡的基本过程,Nature Biotechnology 20, 396 - 399

7、 (2002) Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens Alex J. Harvey, Gordon Speksnijder, Larry R. Baugh, Julie A. Morris 二是器官移植的免疫排斥反应。目前要找到与受体血清型完全相匹配的器官可能性很小,临床上只能靠药物来抑止排斥反应。基因敲除动物模型可能会解决这两个难题。Kuwaki 等采用基因敲除法,将引起超急性排斥反应的半乳糖转移酶基因敲除,用此方法培育的动物的器官可以移植到人体而无排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基

8、因敲除猪,且已经开展了将该基因敲除猪的心脏移植至狒狒体内的实验,经移植后的狒狒存活了2 - 6 个月(均值为78天) ,且均未出现超急性排斥反应的表现。这是目前为止异种心脏移植存活时间最长的例子。虽然异种心脏移植还有许多问题需要解决,但使人类看到了希望。,3在动物育种中的应用,通过基因打靶可以定点地引入优良基因,提高外源基因的稳定性和表达效率,从而改变动物的遗传特性,提高动物的生产性能,增强其抗病力,最终育成满足人们需要的高产、优质、抗病新品种。,基因敲除在猪育种中的应用,用基因打靶的方式对猪的基因进行修饰和改造,可产生一些人类需要的新品种如动物的myostatin(MSTN)基因,对肌纤维的

9、形成具有负调控作用,实验证明,双肌牛即是由于MSTN基因外显子3的个别碱基突变造成的,若能在猪上敲除MSTN基因,将可产生骨骼肌明显增大的双肌品种,提高生产性能。,六、基因敲除存在的问题,基因敲除技术允许科学家极为精确的操作单个基因,遗传改变非常清楚,可以研究以前经典遗传无法了解的基因表现型效应。基因敲除动物的出现使各个科学领域的研究深入到了过去无法到达的深度。 但这一技术也存在一些问题,近年来,人们争论的焦点是:基因敲除动物模型的表型是否是由突变的靶基因造成的。Gerlai 等指出,目前基因敲除的结果忽略了背景基因的作用,由于敲除基因的缺失,动物机体可能产生一种雪崩式的代偿过程,引起基因的第

10、二次改变,因此有理由相信一个复杂的表型改变与某一特定的基因不是完全一对一的因果关系。Nagy 也指出除遗传背景外,还有其他许多因素使基因敲除结果复杂化,由于基因突变体在体内所有组织发育的过程都会丢失,因此不能排除其他器官缺陷参与表型改变的可能性。,七、展望,随着基因敲除动物的应用和发展,今后将主要围绕下列问题进行研究: 进一步发展可诱导型的组织特异性基因敲除动物。 争取在时间、范围、程度等方面对基因敲除进行调控,对系统内的多个基因进行深入的研究。 选择不同的靶基因,从疾病模型的建立到基因治疗,从药物生产到改良动植物的品种等方面进行实践。 对于如何消除背景的混淆效应,一个经典的方法是回交降低背景

11、基因发挥作用的可能性;另一种方法是导入一个外源基因或直接导入蛋白,恢复丢失的功能,如果突变动物表型转为正常,说明表型的改变与基因敲除有关。 目前,绝大部分基因敲除动物来源于小鼠,而据统计这些基因敲除小鼠被敲出的基因仅占小鼠基因组的10 %。最近,美国一机构正倡导各地科学家共同建立一个覆盖小鼠全基因组的基因敲除小鼠资源库。这一资源库的建立必将极大地推动生物医学研究的发展。人类全基因组序列分析已完成,功能基因组学研究正在大规模地开展,基因打靶已成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。,总之,随着现代分子生物学的发展和人类基因组图谱的完成,功能基因组学研究正大规模启动,基因打靶已成为后

12、基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。 基于基因打靶途径建立的医学病理生物模型在人类遗传性疾病的基因治疗中发挥着不可估量的巨大作用。基因打靶技术将对哺乳动物发育生物学、免疫学、肿瘤神经生物学和医学遗传育种等学科产生深远的影响。,第三部分 RNA干扰技术,一、RNA干扰机制奠基人摘得2006年诺贝尔生理奖,据新华社电 瑞典卡罗林斯卡医学院10月2日宣布，将本年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家Andrew Fire （安德鲁菲尔）和Craig Mello（克雷格梅洛），以表彰他们发现了RNA(核糖核酸)干扰机制。 诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，Andrew Fire和Craig M

13、ello获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”。公报指出，RNA干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。,Craig Mello出生于1960年，美国公民，1990年获得哈佛大学生物学博士学位，现任马萨诸塞州医学院分子医学教授。,Andrew Fire出生于1959年，美国公民，1983年获美国麻省理工学院生物学博士学位，现任斯坦福医学院病理学和遗传学教授。,Their Paper,Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabdi

14、 -tis elegans. A Fire, S Xu, MK Montgomery, SA Kostas, SE Driver, and CC MelloNature, February 19, 1998; 391(6669): 806-11.,Abstract,Experimental introduction of RNA into cells can be used in certain biological systems to interfere with the function of an endogenous gene. Such effects have been prop

15、osed to result from a simple antisense mechanism that depends on hybridization between the injected RNA and endogenous messenger RNA transcripts. RNA interference has been used in the nematode Caenorhabditis elegans to manipulate gene expression. Here we investigate the requirements for structure an

16、d delivery of the interfering RNA. To our surprise, we found that double-stranded RNA was substantially more effective at producing interference than was either strand individually. After injection into adult animals, purified single strands had at most a modest effect, whereas double-stranded mixtu

17、res caused potent and specific interference. The effects of this interference were evident in both the injected animals and their progeny. Only a few molecules of injected double-stranded RNA were required per affected cell, arguing against stochiometric interference with endogenous mRNA and suggest

18、ing that there could be a catalytic or amplification component in the interference process.,二、什么是RNA干扰,RNA干扰（ RNA interference，RNAi ）：外源和内源性双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象,三、RNAi的发现,RNAi 是Napoli C D 等在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因,用以增加其花色时发现的。结果出乎预料,转基因的植株不仅没有新基因的表达,反而自身的色素合成也减弱了,一些转基因的花出现了

19、全白色或部分白色。他们把这种导入的基因未表达和植物本身合成色素基因的失活现象命名为共抑制(co suppression) 。 之后,Ramano 等在向粗糙孢菌( Neuros pora crassa) 中导入合成胡萝卜素的基因时造成失活, 他们称为基因静止( quelling) 。 Guo S 等发现正义RNA 与反义RNA 有相同水平的抑制效应,但未能就此现象给出合理的解释。 Fire A 等在研究反义核苷酸时发现在线虫体内,双链RNA ( double st randed RNA ,dsRNA) 能有效地抑制有互补序列的内源性基因,且抑制效果优于单链反义RNA 。 至此,正式提出了双链R

20、NA 诱导的RNAi 的概念,开启了RNAi 研究的序幕。,四、RNAi可能的反应机制,虽然RNAi 作用的确切机制尚不清楚,但目前普遍认可是Bass 假说。具体概括为三个阶段： 起始阶段：siRNA( small interfering RNA , siRNA)的形成 引发阶段： RISC（RNA induced silencing complex)的形成和效应阶段 循环放大阶段：即RdRP（RNA-depended RNA Polymerase)的扩增阶段,1、起始阶段,在细胞内,双链RNA ( dsRNA)由核酸酶(RNase ) Dicer 在ATP 的参与下被处理为21 个23 个碱

21、基的小RNA ,即小干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 。siRNA 是由19个21 个碱基配对形成的双链,并在其3末端有两个游离未配对的核苷酸。 研究发现, siRNA 是RNAi 作用发生的重要中间分子,序列与所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性;双链的两端各有2 个3 个突出的非配对的3碱基;两条单链末端为5端磷酸和3端羟基。这些是细胞赖以区分真正的siRNA 和其他双链RNA 的结构基础。 研究表明,平末端的siRNA 或失去了5磷酸基团的siRNA 不具有RNAi 的功能。,2、引发阶段,siRNA 与Argonaute 蛋白家族及其他未知

22、因素结合,形成siRNA-核蛋白复合物(siRNA-ribonucleoprotein complex , siRNP ) 。 siRNP 在ATP 及其他未知因素参与下,使双链siRNA 解旋形成RNA 诱导的沉默复合物(RNA inducing silencing Complex ,RISC) (RISC 可能以完全单链或两条链解旋但不完全分离的形式存在). 继而RISC 在dsRNA 的介导作用下与互补mRNA 结合,并将其降解。 mRNA 被降解在转录后水平,抑制基因表达,因而又称之为转录后基因沉默( post transcriptional gene silencing ,PTGS)

23、,3、循环放大阶段,在siRNA 诱导的RNAi 过程中,可能还存在siRNA 的循环放大过程,以维持它的RNA 诱导功能。 此过程推测是以siRNA 为引物,互补mRNA 为模板,在RNA 依赖性RNA 合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase ,RdRP) 的作用下,合成新的双链RNA ,再由Dicer 作用,产生新的siRNA , 完成siRNA 的放大过程, 开始新的RNAi 循环。,dsRNA: 外源或内源双链RNA，引起RNAi反应 Dicer酶：RNA酶家族的一员，切割dsRNA siRNA: 即2123nt的小分子干扰RNA片段，由Dicer酶切割长片段

24、dsRNA而成 RISC: 即RNA诱导的沉默复合物，由双链 siRNA 与核酶复合物结合形成，由此开启RNAi反应的效应阶段 RrpA: 某种特定的蛋白质，与siRNA结合形成RISC mRNA: RNAi作用的靶分子,siRNA的形成,RdRP引导的扩增阶段,RISC的形成,效应阶段：mRNA降解,五、RNAi的特性,(1)“共抑制”性。RNAi 是双链RNA 介导的转录后基因沉默机制,它的启动子相当活跃,外源基因可以转录,但不能正常积累mRNA ;RNAi 作用不仅使外源基因在转录后水平上失活,同时诱导与其同源的内源基因沉默。 (2)高效性。试验证明双链RNA干扰mRNA翻译的效率比单纯

25、反义或正义RNA 的抑制效率提高了几个数量级; RNAi 可在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使靶基因表达降到很低水平甚至完全“剔除”,而产生缺失突变体表型。它比基因敲除技术更为便捷,科学家称RNAi 技术为靶基因或靶蛋白的“剔降”(knockdown) 。 (3)高特异性。由dsRNA 降解成的小干扰RNA ,除其正义链3端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外,其余碱基在序列识别中都是必需的,单个碱基的改变即可使RNAi 失效,RNAi 能特异性降解mRNA ,针对同源基因共有序列的RNAi 则可使同源基因全部失活。,(4) 高穿透性。RNAi 具有很强的穿透能力,能在不同的细胞间长距离传递

26、和维持,如在含有双链RNA 的溶液中,喂食表达双链RNA 的细菌等,能向秀丽隐杆线虫导入双链RNA。 (5)“遗传性”。已在线虫中观察到RNAi 效应通过生殖系传递到后代,说明RNAi 具有一定的可遗传性。 (6) 高稳定性。细胞中可能存在天然的稳定siRNA 的机制。此机制可能是siRNA 与某种保护性蛋白结合,从而使其具有相对的稳定性,这些双链RNA 不像反义核酸那样需要多种化学修饰来提高其半衰期。,六、RNAi的应用,1、基因功能研究 简单易行，容易开展 周期短，成本低 高度特异性和高效性 可进行高通量基因分析,示例,由于RNAi 具有高度的序列专一性和有效的干扰活力,可以特异地使特定基

27、因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表明RNAi 能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达,制作多种表型,而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段,产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简单等优势,近来RNAi 成功用于构建转基因动物模型的报导日益增多,标志着RNAi 将成为研究基因功能不可或缺的工具。 除了对某些关键基因的RNAi 研究外,还在哺乳动物细胞中探索了siRNA 在基因组水平上的筛选方法。学者们建立了一个包含8 000 多个基因的siRNA 表达框文库阵列,通过它来高通量筛选NF-kB

28、 信号途径中已知的及Unique 基因。 由此可见,RNA 干扰也正作为筛选成百甚至上千基因的工具,发挥着越来越大的作用。RNAi 为系统地抑制RNA 分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。通过在一段时间内对一个基因RNA 信号的抑制,研究者可以深入研究基因功能,进而描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络。,2、抗肿瘤治疗,多种癌基因可以作为靶点设计相对应siRNA。 Brummelkamp T R等(2002)用逆转录病毒载体将siRNA 导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因K2RAS (V12) 的表达。 对急性髓性白血病的研究已经取得了较好的结果。Scherr M 等(2003)以引起慢

29、性髓性白血病和bcr2abl 阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr2abl 癌基因为靶基因, 设计了对应的siRNA ,并获得了87 % 的有效抑制率。 Wilda M等(2002)用siRNA 抑制白血病BCR/ ABL 融合基因表达也取得了成功。 因此,基于RNAi 技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。有报道称,一种全新生物工程药品“RNA 干扰剂”(非干扰素) 业已浮出水面,并有望在3 年内上市。,3、抗病毒治疗,由于RNAi 是机体中古老而天然的抗病毒机制,目前国外科技人员利用此特点,已设计出针对HIV gag、tat 、rev、nef 等基因的siRNA ,针对丙型肝炎病毒非结构蛋白5B

30、基因的siRNA ,针对脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白和多聚酶基因的siRNA ,针对口蹄疫病毒3D 片段siRNA 等,均在试验中取得理想结果（Kahana R，2004）。 陆续有关通过RNAi 抑制其他病毒在细胞内复制的报道如呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等,国内也已设计出针对口蹄疫病毒VP1 基因的siRNA ,针对丙型肝炎病毒5保守区的siRNA ,针对口蹄疫病毒IRES 和L 串联序列两侧的保守区的siRNA,针对SARS冠状病毒的6 个siRNA ,即RL001 、R L002 、RL003 、RL004 、RL005 和RL006 ,均已取得理想结果。针对病原

31、的siRNA 已经进行到动物实验阶段,向病毒病的有效防治迈出了坚实的一步（Hamazaki H ,2006；Ren W Z ,2004；Golding M C，2006；王海燕等，2004） 由此可见,利用RNAi 技术将使病毒病的有效治疗成为可能。,七、RNAi的展望,综上所述,RNAi 技术在基因功能研究、抗肿瘤治疗、抗病毒治疗、基因应用研究、常见病的治疗等许多方面都是强有力的工具和手段。同时做为新兴的生物技术,还有广阔的研究和应用空间期待着科研人员的探索。 但由于RNAi 机制尚未完全阐明,仍有许多问题尚未得到彻底解答。例如, siRNA 在哺乳动物细胞中抑制mRNA 表达是有效的, 但

32、达不到果蝇细胞那样的高抑制率, 可能是因为生物进化水平越高,调控基因表达系统的复杂程度相应的越高,多种抑制机制间相互作用的频率也越高,抑制作用受到的影响因素也就越多。另外, 在哺乳动物中,RNAi 能否成功地抑制基因表达以及抑制的程度还取决于细胞类型。对线虫来说,可以采用注射、浸泡或喂食的方法转入dsRNA ,而对哺乳动物来说,寻找高效的方式来转入siRNA 以及快速的方式来筛选siRNA仍在进一步探索中。,RNAi 在抗病毒感染中的应用令人鼓舞, 但要取得最终的成功还有很漫长的路要走。其中一个关键的原因是siRNA 并不能对所有病毒RNA 发生作用,有些病毒靶序列可能隐藏在二级结构下, 或者

33、位于高度折叠的区域中, 而有些病毒序列可能与蛋白质形成紧密的复合物, 阻碍了与siRNA 的识别。因此,不仅要选合适的靶序列而且需要反复试验。另一个重要的原因是病毒子代的突变率较高, 这使病毒可逃避siRNA 的识别。为了克服这个障碍,所选病毒RNA 的靶序列必须是高度保守的, 或者设计数对siRNA 同时作用。 总之,RNAi 作为一种新发展起来的分子生物学技术,不可避免地会存在潜在的问题,这就要求研究者在利用该技术时要考虑到生物安全性等诸多问题,以使RNAi 技术更好地为人类服务。,第四部分 蛋白质组学技术,一、概述,1、,2、,3、,4、,5、,双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处

34、理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。蛋白质组研究的技术路线如下图：,样品 细胞、组织、体液,双向电泳,电转印到膜上,图象分析，数据处理,胶上原位酶切,直接1,继续处理2,继续处理3,二、常规蛋白质组学研究技术,Edman降解,氨基酸分析,N端序列,氨基酸组成,肽混合物,MALDI/TOF/MS,肽质量指纹谱,数据库检索,ESI/MS/MS,肽序列标签,PSD/MALDI/ TOF/MS,3,2,蛋白质鉴定,寡核苷酸合成,蛋白实验,免疫组化,肽合成,基因,抗体,蛋白活力,蛋白定位,蛋白质组数据库,1、选择样品制备方法的策略：选择合适的样品制备方法对获得满意的二维电泳图谱是很重

35、要的。由于蛋白样品的来源和类型差异较大，因此，对每一种样品而言，合适的裂解步骤由经验而定目的是尽可能地完全溶解、解离、变性和还原蛋白。 2、明确实验目的与样品制备之关系 当进行样品制备时，很重要的一点是明确其研究目的。 1）是获得尽可能多的蛋白，还是仅获得所感兴趣的某些蛋白? 2）全蛋白表达谱或可重复的清晰图谱哪一个更重要? 尽管采用一些附加的样品制备方法会提高二维电泳图谱的质量，但是同时也会导致某些种类蛋白的丢失。 因此，必须谨慎地权衡上述几者之问的关系来做出决定。,一）样品制备,为了完全分析所有的细胞内蛋白，细胞必须进行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品是否来源于细胞、固体组织或者其他的

36、生物材料，同时也依赖于这种分析是获得所有的蛋白，还是特殊的亚细胞器组分。,1）蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其导致的蛋白降解将使二维电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。,2）如果组织中只有一类蛋白质是有意义的那么在样品制备过程中进行分级分离是必需的。如果从某一特殊的亚细胞器(细胞核、线粒休和质膜)中提取蛋白，那么在进行二维电泳之前，首先应该通过分级分离或其他的方法进行纯化。,3、细胞破碎的注意事项,3）沉淀样品中的蛋白，清除杂质是可选择的步骤，这主要依敕于样品本身和研究目的。它可以除去样品中的盐离子、小分子、离子去污剂、核酸、多糖、脂类和酚类等杂质。通常建议采用

37、最简单的样品制备方法。例如，具有低蛋白浓度和高盐的样品可以被正常地稀释后分析，或脱盐，随后通过冰冻干燥进行聚集，或者通过三氯醋酸、冰丙酮沉淀，再以重泡胀溶液(tehydaration solutmn)溶解。通常利用重泡胀溶液稀释样品已经足够，如果蛋白聚集和杂质难以去除，则沉淀和清除步骤是必需的。,3样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于80。勿反复冻融已制备好的样品。,2细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解。,1尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。,4通过超速离心清除所有的杂质。,5加入尿素之后加温不要超过37， 防止氨甲酰化而修饰蛋白。,

38、4、样品制备原则：,二）二维电泳和蛋白质的分离,1、二维电泳技术的发展及原理 Smithies和Poulik(1956)最早引入了二维电泳技术，他们将纸电泳相淀粉凝胶电泳结合来分离血清蛋白质。随后二维电泳技术经历了更多的发展，并将聚丙烯酰胺介质引入应用，特别是等电聚焦技术在一向的应用，使基于蛋白质电荷属性的一向分离成为可能。目前所应用的二维电泳体系是巾OFarrell等首先于1975年发明，其原理是根据蛋白质的两个一级属性：等电点和相对分子质量的特异性，将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离(等电聚焦)，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，

39、SDSPAGE),2、一维等电聚焦 (isoelectric focusing，IEF ) 电泳,1）原理： 在低pH条件下，蛋白质的静电荷为正；而在高pH条件下，其静电荷为负。若在某一pH值的溶液中，蛋白质的静电荷为零，则此pH值即为该蛋白质的等电点(pI)。由于不同蛋白质有着不同的氨基酸组成，所以蛋白质的等电点取决于其氨基酸组成，是一个物理化学常数。不同蛋白质的等电点分布范围很宽，如某种糖蛋白的等电点值可低至1.8，而溶菌酶的等电点值可高达11.7。把蛋白质加入到含有pH梯度的载体时，如果蛋白质所在点的pH值与其等电点不符，则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷。在高于其等电点的位置时，蛋白

40、质带负电，反之带正电。此时，如果外加一个强电场，蛋白分子会在电场作用下分别向正极或负极漂移，当达到其等电点位置时，蛋白不带电，就不再漂移，这就是等电聚焦电泳的基本原理。,等电聚焦电泳,2）IEF胶条的制备,早期的等电聚焦以低浓度聚丙烯酰胺凝胶为介质，在外加电场的该介质中，连续排列着从正极到负极pI值逐渐增加的合成载体两性电解质(synthetic carrier ampholyte，SCA)。 目前采用固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)胶条，IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基

41、或叔氨基团，它们构成了分布在pH310不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。,3）,3、二维SDS-PAGE电泳,2-DE第二维最常用的是Laemmli非连续缓冲体系，二维凝胶是单一浓度或含线性或非线性梯度的凝胶，其覆盖范围可以使不同相对分子质量大小蛋白质得到有效分离。由于IPG胶黏台在弹性塑料支持膜上，处理起来比用经典OFarrell体系中较脆的IEF管胶容易。平衡后，IPG胶条可直

42、接加在二向SDS-PAGE胶的表面，其方式有垂直或水平两种。一向胶和二向胶的接触是影响电泳重复性的一个很重要因素，一定要避免两者接触面之间产生气泡，否则会产生阻力，使得胶条中蛋白无法顺利迁移至二向，从而产生点的扭曲现象。在垂直胶中，为避免二向电泳时胶条在电极液中移位需用0.5的琼脂糖电极缓冲液溶液封胶二向电泳的电泳缓冲液为Tri-Glycine-SDS系统。封胶时注意琼脂糖溶液的温度不能太高，否则会造成IPG胶上的蛋白质变性或产生蛋白修饰。因为琼脂糖封胶液凝固很快，要避免在封胶时引入气泡。,单向SDSPAGE电泳分辨力差，只能分开50左右种的蛋白。双向电泳可分辨1000种以上的蛋白质，一般为2

43、00015000种。,三）图像分析与细胞蛋白谱的建立,1、必要性 获得蛋白质双向电泳凝胶后，要对凝胶图像进行备份保存，从而以数字化图像的形式存储下来，而且要尽量完整地保留定性和定量信息，以利于进一步的分析。通过对批量双向凝胶图谱的分析，应该获得的信息包括每一块凝胶中所分离得到的总蛋白质点数、双向电泳凝胶之间的批次重现性、蛋白质点的缺失和出现以及多块胶之间蛋白质点的表达丰度的定量变化，而这些工作仅仅依靠眼睛的分辨能力来执行是不现实的，很难系统全面地对整个凝胶图像进行判断，更不用说要对蛋白质点的表达量进行比较分析。,要对上千个蛋白质点进行分析，只有依赖于双向电泳凝胶分析软件，完整的图像处理包括图像

44、的采集和双向电泳图像分析(图):,2、二维凝胶电泳图像采集,1）常用图像采集系统： 常用的图像采集系统有电感偶合装置(change coupled devices,CCD)、光密度扫描仪、激光诱导荧光检测器等。无论何种采集系统，都必须具备透射扫描的功能，因为透射扫描时灵敏度较高可以根据吸光度的大小获得蛋白质点的光密度信息.,2）图像采集的原理 一般来说，该光密度值与蛋白质点的表达丰度成正比，因而保持了图像的真实性，使图像中包含了更丰富的信息，以便于软件分析时的定量比较，由于下一步的图象分析基本上依赖于各个蛋白质点的光密度值相对大小，因此，图像采集质量的好坏关系到图像分析结果的可靠性。影响图像采

45、集质量的因素包括扫描系统的分辨率、灵敏度以及扫描时所选择的图像对比度和明亮度。,3、常用扫描系统的性能 目前常用的可见光扫描仪如Amersham Phamlacia Biotcch公司ImageScanner、Bio-Rad公司的GS-710光密度仪等，可以扫描考马斯亮蓝染色、银染和负染凝胶，扫描方式有透射和反射两种，可以选择黑白、256色和真彩等模式。荧光、化学发光和磷屏扫描仪如Amemham Phamlada Biolech公司Typhoon系列扫描仪，可以选择在可见光范围以外的其他激发波长扫描凝胶，这些凝胶通过肉眼无法观察到颜色，但由于通过呈现方法所得到的蛋白质点在鉴定时无需脱色处理，与

46、下游质谱鉴定的兼容性较好，适用于蛋白质组的自动化和高通量化，使Typhoon类的扫描仪越来越被看好，缺点是该类仪器的费用高，而且荧光染色的试剂费用也很高。,Image Scanner扫描仪 高灵敏度，高分辨，在扫描弱图像时不需散光板，能检测极微量的样品 硬件和软伯的校正功能，提高扫描质量 完整的14-bit图像解析度，准确定量有利于线性范围3.7OD 可选择波长，以降低背景，增加灵敏度 多种扫描速率有利于更快的图像摄录 应用广泛，适用于湿胶，杂胶膜，胶片等各种应用 与各种软件配合，能分析各种1D和2D电泳图,光密度扫描仪 GS800型 产品说明：可分析蛋白电泳胶片、X光胶片、DNA电泳胶片、醋

47、酸纤维薄膜电泳胶片、手写稿、动植物压缩标本（鲜干均可）等各种透明、半透明和不透明的物质。数据图谱均可储存，并可直接打印结果。配备：原装主机、原版分析软件、计算机（英特尔P4 2G以上，256M、60G、17纯平）、彩喷打印机（12001200dpi）。扫描尺寸：305432mm；光学分辨率：12002400dpi;动态范围：最大3.4OD。（用户可自备计算机、打印机）,4、图像采集注意事项 A）常用几类扫描仪的分辨率均可达到1000dpi(dot per inch)以上，但设置dpi值太大，图像保真度虽然提高了，而图像所占字节数也大大增加，使软件在分析图象时对处理器的要求提高了，这样就大大延长

48、了运行时间。在实际应用时，仪器分辨率设置为300dpi、8bits深度为宜，此时一块20cm x 20cm的双向点泳胶(Protean II，Bio-Rad)保存为tif格式的文件后，约占用 6Mb的字节空间，分辨率低于300dpi时会失去某些光密度信息，高于300dpi时，分析软件所能识别的图像光密度信息得不到多大改善，而图形文件大大加大。由于目前所用的凝胶分析软件只能识别256色的图像，要求在扫描时设定图像色彩为256色。,B）图像采集时要注意的问题是扫描强度校正(intensity calibration)，定期的强度校正可以使扫描仪保持光密度的线性范围，保证扫描系统所获得图像的真实性。

49、 C）同时亦要注意扫描条件的重复性，特别是在图像分析时需要进行相互匹配和定量比较的凝胶，扫描参数，包括灰度值、对比度、亮度设定一定要一致。,四）生物质谱技术与蛋白质鉴定,1、生物质谱（mass spectrometry,MS） 技术： 1）什么是生物质谱技术：质谱分析法是通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析的分析方法。 2）发展历程：自1886年Goldstein发明早期质谱仪器常用的离子源，到1942年第一台单聚焦质谱仪商品化，质谱基本上处于理论发展阶段。真正意义上的变革以80年代中期出现的两种新的电离技术：电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离为代表，这两种技术所具有的高灵敏度

50、和高质量检测范围，使得在fmol(10-15)乃至amol(10-18)水平检测相对分子质量高达几十万道尔顿的生物大分子成为可能，从而开拓了质谱学一个崭新的领域生物质谱促使质谱技术在生命科学领域获得广泛的应用和发展.,随着人类基因组全序列的问世，以大规模分析细胞或生物体内的蛋白质为主要内容的蛋白质组研究成为后基因组时代的重要研究内容。蛋白质组研究所必需的高灵敏度、高鉴定速度使得传统的生物化学方法远远不能满是要求，而生物质谱技术的发展，为蛋白质组研究提供了关键的技术手段，成为蛋白质组研究的三大关键技术之一。,3）生物质谱技术的发明者获 2002年诺贝尔化学奖,新华社斯德哥尔摩月日电（记者吴平）瑞

51、典皇家科学院日宣布，把年诺贝尔化学奖授予美国科学家约翰芬恩、日本科学家田中耕一和瑞士科学家库尔特维特里希，以表彰他们发明了对生物大分子进行识别和结构分析的方法。 瑞典皇家科学院发表的新闻公报说，芬恩和田中的贡献在于开发出了对生物大分子进行质谱分析的“软解吸附作用电离法”，维特里希的贡献是开发出了用来确定溶液中生物大分子三维结构的核磁共振技术。他们三人的这些研究成果对于研究包括蛋白质在内的大分子具有“革命性”的意义，使人类可以通过对蛋白质进行详细的分析而加深对生命进程的了解，使新药的开发发生了革命性的变化，并在食品控制、乳腺癌和前列腺癌的早期诊断等其他领域也得到了广泛的应用。,新闻公报说，质谱分

52、析是全世界各个化学实验室都在使用的一种非常重要的分析手段。以前，它只是用于小分子的分析研究。现在，由于芬恩和田中的发明，质谱分析也可以用于生物大分子的分析研究。利用芬恩年所公布的研究成果，研究人员可以获得电荷蛋白质液滴，并最终获得自由盘旋的蛋白质离子，通过使它们运动可以确定其质量，测出飞过指定距离所用的时间。同时，田中还发明了另一种可以造成蛋白质自由盘旋的技术软激光解吸附作用技术。研究人员可以用这种技术把取样击成许多小块，迫使分子释放出来。,芬恩年生于纽约，年获美国耶鲁大学化学博士学位，现为美国弗吉尼亚联邦大学教授。田中年生于日本富山市，毕业于日本东京大学，现是日本京都市岛津制作所研究与开发工

53、程师。维特里希年生于瑞士阿尔贝格，年获瑞士巴塞尔大学无机化学博士学位，现任瑞士苏黎世联邦高等理工学校的分子生物物理学教授和美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所客座教授。,三位科学家的简介,约翰芬恩,田中耕一,库尔特维特里希,4）质谱仪的基本组成,进样系统,离子源,质量分析器,检测器,1.气体扩散 2.直接进样 3.气相色谱,1.电子轰击 2.化学电离 3.场致电离 4.激光,1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间 4.四极杆,A: 离子的相对强度(Y axis) B: 离子的质量与电荷比(m/z, X axis) C: 质谱图中最强的峰称为基峰(base peak) D: 相对于特定的检测器

54、时称为峰的绝对强度 E: 所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在m/z位置而非真实的离子强度和离子. F: 棒状谱(centroidal peak) G: 高斯峰(gauss peak),F,5）质谱图意义,G,6）生物质谱的类型,（1）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF) 主要技术 基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)技术 线性飞行时间质量检测器(time of flight，TOF),MALDI原理：,将分析物分散在基质分子(尼古丁酸及其同系物)中并形成晶体，当用激光(337nm的

55、氮激光)照射晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质样品之间发生电荷转移使样品分子电离。基质的使用是这一电离技术的关键，基质吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相，样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化学键的断裂。基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。,TOF原理,离子源中每一脉冲激光产生的离子先经过一个加速电场，获得动能，再进入一个高真空无电场飞行管道离子在此无电场飞行管道内以在加速电场获得的速度飞行。质量较轻的离子飞行速度快，较早到达检测器，较重的离子飞行速度慢，较晚到达检测器，离子的飞行时间与其质荷比的平方根(mz) 成正

56、比，通过检测飞行时间来测定离子的质荷比。,其中，E为离子在加速电场获得的动能， U为加速电场电压，z为离子所带电荷，m为离子质量，v为离子飞行速度，L为飞行管道长度，t为离子飞行时间，const为一常数。,由 E = Uz =,mv,和 t =,推出 t=const,（2）电喷雾质谱（Electro-Spray Mass Spectrometry）,主要技术：电喷雾电离技术和质量分析器 电喷雾电离方法是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑斥力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆炸为带电的子液滴，这一过程不断

57、重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的形式进入质量分析器。,Drying gas,Nebulizer gas,电喷雾离子化过程,2、运用生物质谱技术鉴定蛋白质,肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting，PMF)鉴定蛋白质 串联质谱（MS/MS）数据鉴定蛋白质技术,1）PMF鉴定蛋白质,（1）原理： 主要是利用蛋白质的各种属性参数(attribute parameter)如相对分子质量、等电点、序列、氨基酸组成、肽质量指纹谱等在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。 用PMF鉴定蛋白质是目前蛋白质组

58、研究中较为常用的鉴定方法这一技术于1993年被多个研究小组分别独立提出，肽质量指纹谱是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹谱，可用于蛋白质的鉴定，即用实验测得的蛋白质酶解肽段质量数在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似肽指纹谱的蛋白质。电泳胶上的蛋白质可被原位酶切或转印到PVDF膜上酶切得到肽混合物，经质谱分析得到PMF，检索数据库进行鉴定。还可以选取肽混合物中的某一肽段通过串联质谱测序鉴定 .,（2）实验路线,（3）主要数据库,（4）示例,Fi

59、g of Ap73a,Result of Ap73a,甲基化尿素,（5）PMF鉴定蛋白的特点,测定肽混合物质量数最有效的质谱仪是 MALDL-TOF-MS，灵敏度高，谱峰简单，每个谱峰代表一种肽段。但是蛋白质可能存在翻译后修饰，电泳过程中某些氨基酸会引入质量修饰(如半胱氨酸烷基化，甲硫氨酸氧化)，这样在蛋白质的PMF中就会有一些质量数与理论值不符，但PMF鉴定的好处就在于不需要将全部肽质量数都与理论值相符。PMF方法可同时处理许多样品，是大规模鉴定的首选方法。 但不能保证成功鉴定所有蛋白质，有相当一部分蛋白质不能单纯靠PMF鉴定，还需要结合序列信息。,2）串联质谱（MS/MS）数据鉴定蛋白质技术,（1）串联质谱获得肽段序列信息原理： 蛋白质由20种氨基酸组成，一段3个氨基酸的肽有203 种可能排列方式，4个氨基酸的肽有204种可能排列方式，一个特定序列的4肽出现的概率为1160000。所以5、6个氨基酸残基的序列片段在一个蛋白质组中已具有很高的特异性，可以用来鉴定蛋白质。 串联质谱仪可获得肽段序列信息。肽段母离子在