PI染色法测细胞周期

1、pi染色法测细胞周期,一） 细胞dna含量检测,细胞固定后用pi （propidium iodide碘化丙啶），染色，因为pi特异性结合于细胞dna，荧光强度与pi的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的dna含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。,单参数直方图,图中2n代表g0/g1期细胞，4n代表g2/m期细胞，两者中间代表s期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式dna图,dna细胞周期分析,细胞周期,g2,m,g0,g1,s,200,400,600,800,1000,s,dna分析,dna含量,细胞数量,2倍体,异倍体,4倍体,肿瘤组织中的各种dna倍体,含量与凋亡

2、关系,dna亚g1峰的检测：利用pi染色，检测具有亚g1期dna含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。 凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将dna降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的dna片段从细胞内流出，造成总体dna含量减少，成为亚2倍体。,2. 凋亡研究,在g0/g1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。 检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。,annexin v assay,图 annexin v/pi双标记分析细胞凋亡和坏死,date acquired: 14-jan-03 file: 7gy 4hr.001 source

3、: dongbo diploid: 100.00 % dip g0-g1: 73.12 % at 48.16 dip g2-m: 9.59 % at 96.33 dip s: 17.29 % g2/g1: 2.00 dip %cv: 6.04 apoptosis: 13.66 % mean: 27.48,图 fcm测试细胞周 期分布和凋亡,根据凋亡细胞的特点来检测,在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏 凋亡细胞的fsc ？ssc ？ 细胞坏死时，细胞肿胀，fsc ？，ssc ？,正

4、常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg dna/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的dna含量。在细胞周期(g0，g1，s，g2 ，m)的各个时期，dna含量随各时相呈现出周期性的变化：在g1期，细胞开始rna和蛋白质的合成，但dna含量仍保持二倍体；,进入s期后，dna开始合成，这时细胞核内dna的含量介于g1和g2期之间；当dna复制结束成为4倍体时，细胞进入g2期，g2期细胞继续合成rna及蛋白质，直到进入m期，因此，单纯从dna含量无法区分g2期和m期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(g0

5、期)，而g0期从dna含量上同样无法与g1期区分。因此，整个复制周期可以描述为g0/g1，s，g2/m期。,通过核酸染料标记dna，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出g0/g1，s及g2/m的百分含量，了解细胞的增殖能力；结合dna指数分析，还可进行凋亡、异倍体等检测。,g2,m,g0,g1,s,0,200,400,600,800,1000,s,dna analysis,dna content,count,normal cell cycle,细胞浓度及质量要求,单细胞和核的上机浓度应约106/ml。浓度太低，上机时样本的流速不得不提高，这样就会影响检测的cv。浓度太

6、高，则可能导致染料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影响cv和检测结果。 制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量：细胞是否聚集或过多的碎片。,染料的选择取决于流式激光的配置。488nm的激光下应用pi(碘化丙啶)，由于pi也与rna结合，所以分析前样本应用rnase处理.。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。pi的推荐浓度是至少20ug/106 个细胞。其最佳浓度为50ug/106 个细胞。,操作步骤,取一瓶生长期的a549细胞，倒掉瓶中旧的培养液，加入3mlpbs，细胞生长面在下轻轻晃动细胞瓶，然后去掉液体，加入1ml胰蛋白酶消化15分钟（以镜下观察决定） 加入5mlpbs轻轻吹打细胞生长面，制成细胞悬液，将细胞悬液移至15ml离心管中1500rpm离心5min，去上清。 加入500ulpbs轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2ml-2095%冷乙醇，混匀后固定30min。,加入5mlpbs，1500rpm离心5min，去上清液。 加入5mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清液。 加入800ulpi染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色30min 上机检测。,影响荧光染色的因素,温度：温度高于20时，即出现温度淬灭。 2、ph