临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制3讲述.ppt

1、临床基因扩增检测标本的处理、保存和核酸提取方法与质量控制、童永清、武汉高等院校人民医院临床分子诊断中心武汉高等院校人民医院检测医学中心、核酸扩增检测标本的采集、运输、保存的重要性，是临床检测质量保证的重要环节解决实验室检测相关医疗纠纷的方法之一，核酸提取的重要性，核酸提取是临床PCR检测的最重要部分。 手动操作的主要部分核酸提取的成败是临床PCR检测的成败临床PCR检测操作中最容易成为问题的环节，分析前的质量控制标本采集、运输、预处理、储藏等标本采集、运输和保存都很快，尤其是用于细小病毒分离、抗原或核检的标本必须及早检测，而不能及时检测的标本低温容器可在短时间内进行低温保存，反复冷冻保存的标本

2、尽量采取病变部位或接近病变部位的大量标本是不可避免的，标本采集、标本采集时间对放大检查结果的影响标本采集部位的准备标本的类型和采集量采样质量的评价采样和运输容器标本采集中的污染防止、标本运输、采样在样品中加入适当的稳定剂，例如为了测定RNA而加入了GITC的血清(拉力赛)样品或为了测定DNA而加入EDTA抗凝血剂等，可以在室温下运输或邮寄。 实验室应根据所测靶核酸的特性，相应规定各种临床样品的输送条件。 检体种类、活检组织、目的地选择检体种类、检体采取器、检体采取器、检体类型决定检体采取器、检体采取外周血(HBV/EBV-DNA，)不可溶血RNA检查：立即分离血浆，放入没有RNase的远芯管中

3、，EBV-DNA检查(慎重使用) :慎重使用LC 避免RBC混入，标本采用其他体液(TB/EBV-DNA等病原)痰：取深部痰液中段尿鼻咽部：咽后壁分泌物EBV-DNA分泌物(CT/UU/HPV-DNA等病原)采样时取上皮细胞球将雨刮器冲洗至一盏茶，取切片组织标本， 40%的肿瘤组织：直接提取40%的核酸肿瘤组织：采用不同的方式，标本必须保存fiii 57 federal register 7176 (修饰a t 42 CFR 493.1445 (e ) (5) . DNA以正常人的同类标本为对照的不同标本类型用不同的提取方法4保存，长时间-20保存的RNA以正常人的同类标本为对照的不同标本类型

4、采用不同的提取方法，严格遵照手册制定了避免分解的-20保存、长时间-70保存、标准化的核酸提取文件， 以实验操作手工作业为主，固定人员，熟练操作，方法一致，不同厂家的萃取试剂盒混合在质量控制手册中进行要不得酚三氯甲烷/乙醇沉淀，Chelex煮沸，玻璃磨粉机吸附，硅凝胶膜/离心柱，磁珠法， 样品核酸提取的进行方向、高产率、高纯度、低拷贝样品的检测、无PCR试剂杂质、PCR不受抑制、稳定、均匀、可靠的检查结果、自动化、高效提取、高通量、一体化、未来核酸提取技术的必要要素、普通核酸提取试剂将目标核酸从细胞球内释放的原理， 靶核酸可以与宿主细胞球匹配，核内游离以及细胞球内的各种形态一般使用存在于细胞球

5、内的洗涤剂(例如Triton-100 )分解细胞球，通过蛋白酶k等蛋白分解酶催化剂消化与核酸结合的蛋白质，从细胞球内释放靶核酸。核酸的分离纯化、核酸的分离纯化是除去蛋白脂质等妨碍核酸扩增的物质。 作为经典方法的硅吸附法，对于商品核酸提取试剂盒，在临床实验室使用之前，必须做评估其核酸提取纯度和效率。 在DNA提取的典型方法，即所谓的“酚三氯甲烷萃取法”、RNA提取的独特性、临床标本和实验室环境中，存在大量对RNA具有强降解作用的RNA，RNA耐高温，不易失活。 避免RNase对标本的污染，防止RNase对提取的RNA的分解，是成功提取RNA的关键。 RNA提取中使用的容器的处理，对于高压灭菌后的

6、一次性物品的塑胶制品，例如试管、离心管等基本上没有RNase，可以直接用于RNA的制造和储存。 实验室用的一般玻璃容器多为RNase污染，使用前需要180干燥8小时以上或者使用0.1%碳酸吡咯二乙酯(DEPC )的DEPC是RNase的强抑制剂。 充满DEPC的器皿在37下放置2小时，用灭菌水冲洗数次，用100干燥15分钟，最后用高压蒸汽烧15分钟。 通过上述处理可以除去容器上的微量DEPC，防止DEPC在羧甲基化作用下修饰RNA嘌呤盐化学基。 RNA萃取所用溶液的准备、RNA萃取所需溶液的制备，必须用高压灭菌后的水和RNA研究专用药剂制备溶液，用干燥的药匙取出试剂，将溶液放入没有RNase的

7、玻璃容器中。 如果可能的话，溶液全部用0.1C在37处处理至少12小时，之后用100进行15分钟或者高压蒸汽灭菌。 需要注意的是，由于DEPC与胺类迅速发生化学反应，不能用于含有Tris等的缓冲液的处理，因此可以保存数瓶新的未开封的Tris试剂，制备无RNase的溶液。 RNA提取中RNase污染的控制，实验算子的手是RNase污染的最主要潜在来源。 对策是在准备RNA精制用的实验材料和溶液时，以及在有关RNA的提取操作的全过程中，佩戴一次性手套。 在RNA提取实验中，必须频繁更换手套。 RNA提取常用方法、界面激活剂蛋白酶k、三氯甲烷酚萃取法。 胍盐萃取结合三氯甲烷酚萃取法。 胍盐萃取结合玻

8、璃料、二氧化硅等粒子悬浮吸附法等。核酸提取的改进方法、旋转离心柱(SPIN COLUMN )方法玻璃料吸附法二氧化硅(Se )或硅藻吸附法微量全血核酸萃取法： NaI方法等方法：疏水性Immobilon-P膜、全自动核酸纯化装置、旋转离心柱(SPIN COLUMN ) 原理上目前的旋转离心柱系统通常分为三个部分：第一部分是利用裂解液破碎细胞球，释放细胞球中的核酸的第二部分是特异性吸附所释放的核酸到特定的硅载体上，当然，该载体对核酸只有很强的亲和力和吸附力，而其它生化成分， 例如，对蛋白质、粗多糖、脂质既不相配也不吸附的第3部分是洗脱吸附在特定载体上的核酸，得到纯化核酸。 临床标本中的PCR反应

9、抑制物、内源性：免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂质、粘蛋白、尿素、络离子、胆盐、粗多糖等。 外来性的：如肝素抗凝血剂、胞里肌肉和硝酸胞里肌肉、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或者采样器材中含有的阻碍物。 注意事项、肝素的作用机制、肝素对MLV反转录酶和TAQ DNA多聚酶均有较强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝血，在核酸纯化过程中，标本中的肝素可与DNA和RNA结合，而肝素和核酸本身带正电荷。 标本煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后的凝胶过滤、反复乙醇沉淀等不能消除肝素的这种干扰作用作用。 每g核酸标本加入0.1U的肝素，可以100%抑制酶活力。标

10、本中加入肝素酶催化剂I或13 U/g核酸(5mmtrisph7.5、1mmcacl2、40urnasin25小时)可以去除肝素的抑制作用。 血色素、乳铁蛋白、血色素和乳铁蛋白分别是血红细胞和白细胞内的主要PCR抑制物，它们都含有铁元素。 抑制机制可能与1 )这些个的蛋白质向PCR混合物释放铁元素络离子有关。 研究了抑制铁元素的效果，发现干扰DNA合成，胆色素、胆盐、氯化血红素等血色素诱导体也是PCR抑制物。 2 )血红素(Heme )可通过抑制回流调节DNA多聚酶活性，并协调血红细胞内血色素成分的合成。 氯化血红素直接作用于DNA多聚酶，所以也观察到了与靶DNA竞争而成为阻化剂和核苷酸的非竞争

11、性阻化剂。 3 )靶核酸DNA不能与DNA多聚酶接触，因为它被血液中大量的血液凝固有机物所包围。 血色素、1%(V/V )血液与Mg2浓度无关，可完全抑制Taq酶活力。 Tth多聚酶可通过含有4%(V/V )血液的PCR反应混合液进行扩增，加上1U单链DNA结合蛋白质T4基因32蛋白(gp32 )，即使Tth多聚酶含有8%(V/V )血液，也可进行扩增。 因此，Tth多聚酶和gp32蛋白可以直接扩增靶DNA，而无需从临床标本中提取纯化的核酸。 热稳定的DNA多聚酶不同，对临床标本中抑制物质的易感性也不同。 IgG、IgG的抑制作用是由于与单链DNA的相互作用，靶DNA不能与DNA多聚酶相互作用

12、，将煮沸作为标本处理方法使用，或增强对PCR反应的抑制，去除或减轻抑制的几种方法， NaOH处理可以中和临床标本中的Taq DNA多聚酶阻化剂，但这种方法，一些去除或减轻抑制的方法添加0.6% (wt/vol )牛血清蛋白(BSA )可以降低血液对Taq DNA多聚酶的抑制效果，达到2%(vol/vol ) 在血液存在下也能成功扩增，但通常血液含量只有0.2的BSA也能增加rTth或Taq DNA多聚酶的扩增能力，使粪便和肉类标本中对障碍物的抵抗力分别提高10倍和20倍。 单链DNA结合T4基因32蛋白(gp32 )具有BSA那样的增强效果。 核酸纯化、核酸分离纯化技术始于二十世纪五十年代，在

13、七十年代和八十年代传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到普遍应用和普及。 传统的核酸提取方法常涉及清洗剂的分解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等工艺。 提取核酸的质量、纯化的目的核酸的完全性：可以使用凝胶电泳将样品的核酸提取物与核酸基准进行比较测定。 核酸提取的收率：可用A260测定。 核酸纯度：可以通过提取物A260/A280比率来判定血清或血浆中的病原体核酸的精制纯度：使用已知的病原体含量的溶血和/或血脂标本用被评价试剂提取、进行扩增检查，将其结果进行比较， 临床样品核酸提取中可能存在的来自样品的抑制及干扰物质核酸提取中：乙亚胺四冰乙酸(EDTA )、十烷基硫酸盐(SDS )等清洗剂、异硫

14、氰酸胍、盐酸胍等chaotrope试剂、苯酚、三氯甲烷、乙醇等有机溶剂。核酸样品制备和扩增检测的质量控制、临床样品中可能存在的抑制/干扰作用物的质量控制措施核酸提取和扩增有效性的质量控制、临床样品中可能存在的抑制/干扰作用物的质量控制措施、质量控制措施：内部质量管理(internal control，IC ) (通常称为内标)的方法内核酸提取的质量控制、提取过程的质量控制、强阳性质量控制品的设立、提取过程中加入彩色的内标、临界阳性质量控制品的设立，各质量控制品和内标符合说明书的标准，感染性疾病的分子诊断、实例1、乙型肝炎病毒检查、乙型肝炎二半检查、大三阳1、样本类型：血浆血清(血浆血清10倍)

15、、2、 阴性结果解读： DNA阴性不是无感染，判断是否感染需要HBsAg检查，3，何时需要检查HBV-DNA: a，HBsAg ()大三阳患者HBV-DNA阴性率5-10%小三阳患者HBV-DNA阴性率30%左右，48，c 欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因是全世界约1.2亿人感染HCV，流行率2%中国的HCV约3800万HCV感染者每年新出现c型肝炎的病例约3.5万例-WHO，c型肝炎检查，注意事项： a、血浆、血清b、不能即时检验，不能即时检验的情况抗体检查阴性时，不一定感染，需要HCV-RNA、肿瘤的分子诊断，实例2，N Engl J Med. 2011 365:158-167，非小细胞球肺癌分子分型，Mod Pathol. 2008； 21 Suppl 2:S16-22、模型路径ol.2012。 25(3):347-69、j clin正版。 31(8):1081-8，不同化学疗法方案间疗效、组织标本质量控制、组织一盏茶HE染色、形态学检查组织量不脚丫子时(1)基因测