（推荐精选）HPLC方法开发——流动相的选择.ppt

1、HPLC方法开发流动相的选择，1， 1 .流动相的一般要求流动是根据对样品具有一定溶解能力的流动相具有一定的惰性流动而不改变填充剂的任何性质的高纯度的流动相的黏性系数尽可能小的流动相的化学性质适合使用的检测器选择流动相沸点不太低的挥发性溶剂流动相进行配置后调制过滤流动相然后脱气，2，2 .常用溶剂的重要性质极性黏性系数沸点紫外截止波长，3，常用溶剂残奥表，4，3 .过滤，溶剂和样品过滤非常重要，保护柱、设备，消除污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料粒子细，色谱柱的内腔小，溶剂和样品中的细粒子容易堵塞色谱柱和毛细管。 设备：溶剂和样品中的微粒子在增加样品阀的堵塞和磨损的同时，也增加泵头内的蓝

2、宝石阿匹斯神活塞杆和活塞的磨损。 5、4 .脱气、氦原子瓦斯气体脱气法：液体中氦原子瓦斯气体的溶解度低于空气，连续吹氦原子进行脱气，效果好，但成本高。 医学超声脱气法：将流动相放入医学超声容器，用医学超声振动1015分钟。 在线真空脱气法： Agilent1100LC真空脱粒机采用膜渗透技术进行在线脱气。 6、5 .溶剂过滤烟嘴防护，溶剂质量和污染，藻类生长堵塞溶剂过滤烟嘴，影响泵运行，特别是影响水溶液和磷酸盐缓冲液。 有效防止溶剂瓶内溶剂过滤烟嘴堵塞的方法如下。 (1)严格实施溶剂过滤；(2)尽量使用琥珀色的溶剂瓶容纳水溶液或磷酸盐缓冲液，而不使用存放了好几天的蒸馏水和磷酸盐缓冲液，以免溶剂

3、瓶暴露于直射日光中。 堵塞后的处理方法：将过滤烟嘴头从碘针织面料上取下，在浓硝酸(35% )中浸渍1h，用蒸馏水洗净。 7、6流动相的储藏、流动相一般储藏在玻璃、聚四拉夫领氟乙烯容器内，不要储藏在塑料容器内。 储藏容器一定要盖好，防止溶剂挥发引起的组成变化，防止氧气和灰尘溶入流动相。 磷酸盐、冰乙酸盐缓冲液容易发霉，请尽可能新鲜地调制后使用，并在储藏时不要超过规定的有效期。 容器要定期清洗，特别是装有水、缓冲液、混合溶液的瓶子要除去底部的杂质沉淀和可生长的微生物。8、7HPLC实验用水、HPLC实验用水除了满足药典对纯化水的一般要求外，还必须满足以下要求：HPLC级水增紫外吸收要求：在1cm池

4、中，HPLC级水为空白，对190nm、200nm和250400nm的吸收，9、8 .等度溶出等度溶出在同一分析周期内流动相组成保持一定，适用于成分数少、成分极性有一定差异的样品，多用于含量的测定。 优点：基线平稳，保持时间重现性好，对流动相纯度要求低。 缺点：早洗脱的色谱峰分离度差，晚洗脱的色谱峰理论塔板数低。 10、9 .渐变洗脱和渐变洗脱用于在一个分析周期中对溶剂极性、离子力、pH等流动相的组成进行计程仪控制，分析成分数多的样品。 优点：缩短分析时间，提高分离度，改善峰值形状，提高检测灵敏度，缺点：增加基线漂移的长平衡时间，11，9 .进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，组成不断变化，造成特

5、殊问题， 用于梯度洗脱的溶剂纯度必须注意溶剂的相容性，因为要求更高的混合溶剂的黏性系数根据组成经常变化，所以梯度洗脱时压力经常出现变化。 注意坡度洗脱时的压力不要超过输液泵和色谱柱所能承受的最大压力。 每次坡度洗脱时，1030倍柱容积的初始流动相就需要流过柱，恢复到初始状态。12、10流动相的pH值、反相络离子抑制技术：在使用反相色谱分离弱酸性或弱碱性样品时，通过调节流动相的pH值，抑制样品成分的分离，增加成分在固定相中的保持，改善峰形状的技术。 就弱酸性而言，流动相的pH值越小，成分的离解平衡常数Ka值越小，当pH值远远小于弱酸性的pKa值时，就弱酸性主要作为分子存在的弱碱而言，流动相的pH

6、值越大，成分的Ka值越大，pH值大于弱碱的pKa值在分析主要以分子形式存在的弱酸性样品时，通常在流动相中添加少量弱酸性，通常为1050mmol/L磷酸盐缓冲液，0.05%TFA； 分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用三氨基乙烷溶液10mmol/L，nh4oh0.050.5%。 13、10流动相的pH值，溶液的pH值与化合物的pKa相等时，化合物半解离。 在pKa1.5的范围内，保留随pH的变化而显着变化。 超过该pH范围时，化合物完全解离或不可解，随pH值的变化小。 了解化合物的pKa值，可以在pKa2的范围外调节流动相的pH值，使化合物的峰形状良好，保持一定，使确立的方法具有耐久

7、性。 在14、10流动相的pH值、15、11 .缓冲盐、HPLC用缓冲盐的情况下，由于泵头内的缓冲盐溶液有高压盐分解现象，析出的细小盐粒非常硬，附着在蓝宝石阿匹斯神拉杆上，随着蓝宝石阿匹斯神拉杆的往复运动，容易产生损伤，并且上线了seaa 清扫液可以调制： 90%水10%异丙醇，抑制菌类生长，减小水的表面张力。 盐溶液和有机溶剂溶液混合后，盐溶液不会沉淀，可以与有机溶剂溶液完全混合。 但是在比例阀的混合点，由于重力作用，盐粒子沉淀，这时，吸液口在混合器下面的含盐流动相吸液口在混合器上面的含盐流动相应该放置。 16，11 .缓冲盐，17，12 .络离子对试剂，作用原理：由于络离子对试剂和分析对象

8、物质(在溶液状态下显示与络离子对试剂相反的电荷的情况较多)结合成为络离子对而成为中性，因此出现无极性，柱有保留行为。 试剂选择：分析酸性(作用化学基)样品一般为阳络离子对试剂(四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵)、盐化学基样品用阴络离子对试剂(苯磺酸金属钍、辛烷磺酸钠十二烷基磺酸纳金属钍) 络离子的分离反应历程络离子对试剂的烷基c链越长，生成的络离子对与固定相的亲和力越大，因此成分的保留值也越大。 使用的络离子对试剂浓度尽可能低(一般为0.005mol/L )，保证对柱填充剂稳定性的影响最小，清洗容易。 18、12 .络离子对试剂、络离子对试剂的使用中留心的要素为1、络离子对的浓度，在这种情况下，在

9、满足要求的前提下越低越好。 2 .络离子对溶液的pH值，这是进行分离的最重要因素，只能在缓冲液中测定pH值，不能混合有机相进行测定。 3 .使用络离子对试剂时，必须在平衡时间内留心的，正常情况下60-90分钟即可达到完全平衡。 另外，如果实验结束后不清洗2小时以上，柱子可能会不可逆地损伤。 4 .用络离子对进行实验的柱子尽量和其他的非络离子对分开使用。 19、13 .对各种检测器的流动相的特别要求，13.1 UV :将截止波长：溶剂放入1cm的比色皿中，参照空气，测量入射波长，溶剂的吸光率A1逐渐降低时的波长。中国药典对UV法溶剂的要求是，空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度： 220240nm范围内超过0.40为要不得，241250nm范围内超过0.20为要不得，251300nm范围内超过0.10为要不得，300nm以上为0.05、220 13 .要不得ELSD超过各种检测器要求使流动相蒸发，因此不能使用不易挥发的物质调节流动相的pH。 21、13 .各种检测器对流动相的特别要求是，13.3 MSD是盐对质量谱的损伤较大，因此在流动相的选择上应避免使用非易失性盐，尽量减少易失性盐的使用。 因此，一