第十章外源基因表达与基因工程药物.ppt

1、第十章外源基因表达和基因工程学科药物，第一节概论，外源基因表达：利用细胞内相关酶系及其调节系统将外源基因转移到肽链或加工成活性蛋白的过程。特别是利用分子生物学技术编码外源蛋白的基因在体外重组为适当的表达载体，通过相关技术引入宿主细胞。通过宿主细胞的转录、翻译或翻译后的修饰酶系及其调节系统，在宿主细胞中合成或分泌具有原始生物活性的蛋白质。目的：利用不能直接从自然中提取、分离、提炼、制造成本、产量等限制或不能用化学方法合成的多肽、蛋白质、酶等生物分子药物，利用细胞、组织或器官或生命的克隆、转录、翻译和调节系统，翻译后处理、修改等体系，基因工程概念、基因工程改变生物学特性或创造新生物类型的技术，基因

2、工程的发展史，1，基因表达的基本原理，基因表达典型的基因表达是基因转录和翻译，产生具有生物活性的蛋白质的过程。遗传工程学科技术的核心是基因表现技术。基因重组的主要目的是使目的基因在一个细胞中高效表达。，原核生物和真核生物之间的基因表现差异，原核生物和真核生物肽链合成过程的主要差异，蛋白质合成的特征，1。真核生物的蛋白质合成与mRNA的转录分离，原核生物的蛋白质合成与mRNA的转录结合并行。2。真核生物的mRNA是简单的原核生物中的mRNA是多纯的。3 .真核生物合成体系的RNA和蛋白质在结构上不同于原核生物，线粒体具有独立的蛋白质生物合成体系。抑制蛋白介导的负调控和cAMP-CAP介导的正调控

3、共同负责原核体内党员的协调利用翻译水平。1.转换和翻译的结合提高了基因表达调控的效果。2.SD序列影响翻译的开始速度。3.翻译抑制将蛋白质和自己的mRNA结合起来，反转实现翻译开始的调节4.mRNA密码子的编码频率影响。翻译的扩展速度，基因表达调控的影响因素，原核生物，(a)真核生物染色质结构影响基因转录。1.活性染色质对核酸酶很敏感。2.活性染色质的组蛋白改变了。3.RNA聚合酶结合部位的上游和下游徐璐其他超螺旋结构4。CpG岛甲基化水平降低(2)纯食作用源(启动子、强化者和沉默者)在基因表达活性(3)转录因子的调节(4)真核生物转录后仍能调节mRNA的结构和功能，然后水平是原核、基因表达调

4、节的影响因素，真核生物、2 基因工程的基本过程，目的基因获取连接酶的作用，结合具有完全复制能力的重组DNA分子，引入适当的受体细胞。 重组DNA分子被引入受体细胞并扩增，基因工程的基本过程，重组体的筛选和鉴定：直接筛选法(如抗药标记选择)和免疫学方法目的的基因表达和分离纯化：原核和真核表达，1，目的基因获取，外源基因表达的第一步是目的基因获得目的基因的主要方法。化学合成RT-PCR在包含目的基因的总RNA或mRNA中放大cDNA文库或基因组文库中的PCR扩增，通过杂交技术从多种文库中筛选，聚合酶链式反应(PCR)，聚合酶链式反应(PCR)，聚合酶Chr(PCR)原理是在适当的缓冲液(Mg2)反

5、应体系中，根据碱基对原理，利用DNA聚合酶催化和dNTPs依赖DNA模板特性指导DNA合成的基本步骤。跨性别：双链DNA解体是单链(90以上)退火(复性):引物和模板DNA单链的互补序列对结合(约50)扩展：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，将dNTP作为反应原料，靶序列用作模板，引诱物、酶突变诊断细菌、病毒、寄生虫检查和诊断人类基因组工程学科遗传图谱构建分析DNA测序；表达图法医犯罪现场标本是肿瘤各种肿瘤检查其他，2，目的基因和表达载体的重组，重组载体的组成：切割，修饰，在连接酶的作用下形成完全可复制的重组体。(阿尔伯特爱因斯坦，美国电视电视剧)，(a)对于向量，外源基因表

6、达，第二个问题是选择适当的表达向量，并将目的基因重组为表达向量。表达载体主要包括质粒载体、噬菌体或病毒载体。表达载体是目的基因在宿主细胞中保证遗传、转录、翻译及可能的翻译后修饰加工。基因工程学科载体的基本条件，在宿主细胞中进行克隆繁殖，具有易于进入宿主细胞的限制性核酸内切酶部位，可以方便地插入外来核酸片段，插入后不进入宿主细胞，不影响细胞中的复制。容易筛选的标记很容易从宿主细胞中分离纯化。根据基因工程载体分类、载体的分子生物学特性，分割质粒状载体环状dsDNA分子。病毒形矢量环、线性、ss-和ds-DNA分子形成病毒粒子混合载体质粒和病毒特性，特性的转换取决于宿主细胞生物学特性。克隆载体质粒、

7、噬菌体、粘性质粒、M13噬菌体表达载体大肠杆菌表达载体、哺乳动物细胞表达载体质粒(plasmid)是可以独立于细菌染色体以外的遗传物质进行自行克隆的双链闭环DNA分子、质粒的特征，大部分质粒DNA是环状双链DNA分子克隆类型，是严密和松弛型共价闭环。松弛复制氨苄西林酶耐药性；化学显色过滤、噬菌体载体、特征双链DNA分子(线性或环)两端均有12个nt单链互补粘性末端(中间区域约三分之一长度)，可以在E.Coli中大量复制15Kb左右的外源基因。矢量类型(两个茄子)插入型矢量： (中间区域约三分之一长度)即插入惰性效果替代型载体(替代型载体):提高外源DNA复制能力，M13噬菌体(M13 phag

8、e)，只具有F性菌毛的大肠杆菌基因组DNA总因此，复制的碎片通常在1kb内，复制的300-400bp的碎片非常稳定。，由粘尾质粒(cosmid)、DNA两端的粘尾区域(COS区域)和粒子组成的环形双链DNA特征：包含Amp、Tet等恒星标记。在体外包装一个或多个酶切部位，添加特异性启动子，双向转录分子量小。大容量/选定的AP板粘性DNA质粒可以连接到真核细胞中可生活的元素，在真核中传播和筛选，大容量载体，细菌人工染色体(BACs): E.coli F质粒，供体DNA300kb，大基因组分析P1人工染色体(PACs):大基因组分析酵母人工染色体(YACs):酿酒酵母丝粒子，端粒，自主复制序列，捐

9、赠者DNA2000kb，大基因组分析和YAC转基因动物，质粒构建战略，质粒载体需要的三个部分复制区域：包括复制起点的选择标记：抵抗基因；复制网站：促进外源DNA插入，缩短质粒构建战略，矢量长度，扩展载体接受能力合理增加酶切位数，引入多克隆网站形成多用途辅助序列，提供质粒新产品设计的特殊选择标记，为宿主提供易于检测的表型，穿梭矢量，最好是细菌质粒的复制原点和选择标记哺乳动物细胞的病毒载体包含原核基因序列。克隆人和抗性基因中含有哺乳动物细胞启动子和增强元素，使外源基因能够有效地转录终止信号和聚(A)信号。可选择的剪切信号包含一种或多种限制性内切酶。真核细胞载体，酵母载体构成遗传标记。调节序列(AR

10、S，环质粒DNA，启动子)；重组为质粒DNA和酵母DNA的梭梭质粒杆状病毒载体昆虫细胞多角病毒载体，适合蛋白质修饰、加工和运输体系产物可溶性表达复制大的外源DNA不感染脊椎动物，(2)适合重组。体外重组技术基于可在体外应用的一系列DNA限制性内切酶和DNA连接酶，以及PCR技术的推广。目的基因和载体DNA分子体外重组的关键是选择合适的重组部位，切割部位。并且切割后适当的条件是将目的基因和载体DNA分子联系起来，得到重组分子。基因工程相关酶、限制性核酸内切酶、双链DNA分子中特定核苷酸序列的识别，相应地切割DNA双链结构的核酸内切酶、类型：修饰酶活性及依赖ATP的限制性内切酶活性型：内切酶活性及

11、修饰酶活性，特异性强。切割部位的特异性和识别部位的特异性，一般在识别序列内，由切割型：作用方式同型、命名方法、类型限制性核酸内切酶、基本特性识别ds-DNA中-8个连接碱基对组成的特定半文盲序列中断后形成的DNA片段具有互补碱基的单链扩张端(粘性端)或平端。5ctgcag33gacgtc5，5ggatc3ctag5，5gatc3ctag5，5gatc3ctag5，5ggc3ccg5，hae，MBO，bamh，PST，分段：单酶、双酶、部分酶与粘性末端DNA片段的连接通过不同的DNA片段相互补充的粘性末端对连接分子之间同一片段的两个互补端之间的碱基对形成环分子内部连接，载体与目的片段相连接。影响

12、限制性内切酶活性的因素DNA纯度DNA甲基化水平底物DNA的分子结构反应温度反应温度反应系统构成酶量、反应体积、酶切时间。酶的用途DNA重组和构建新的基因组文库DNA物理图也促进DNA分子杂交剂DNA放射性探针DNA序列分析，DNA连接酶，封闭DNA链的槽口酶，能量促进DNA链的5。DNA重组和质粒构建，大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端DNA分子，NAD可用作辅助因子T4 DNA连接酶。需要粘性末端连接，高浓度扁平末端连接，3-OH和5-PO4。催化过程需要ATP和Mg、聚合酶、DNA(RNA)作为模板，促进DNA(RNA)的体外合成。特点：用前体催化脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)合成

13、DNA，需要模板和引物的存在。不能合成新的DNA链催化剂dNTP。大肠杆菌DNA聚合酶：53的聚合作用3 5的外体酶活性53外体酶活性Klenow聚合酶：53聚合酶活性3 5外体酶活性53没有外体酶活性53外体酶活性，将DNA短链端填补成双链，填补聚合酶的分类和特征。T4-DNA聚合酶：53无外体酶活性，需要具有引物的单链DNA作为模板，3 5外体酶活性Taq DNA聚合酶：53聚合酶活性53外体酶活性，无链替换合成能力3 5外体酶活性，没有适合DNA序列分析和PCR反应的热稳定性，逆转录酶(rereo se)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase):有助于去除DNA /RNA 5-P，在准备载体时防止载体本身的连接，提高重组效率