BD流式原理及应用.ppt

1、,BD公司生物科学部,流式细胞仪的应用,TO HELP ALL PEOPLE LIVE HEALTHY LIVES,成立于1897年 位居财富周刊500强的大型跨国公司 产品涵盖诸多医疗领域 BD Biosciences生物科学系统(全球最大的流式细胞仪生产商/供应商) 注射器产品系列：疫苗注射器 临床标本采集系统 感染性疾病诊断系统 在中国各大城市设有代表处,市场情况,1973年世界第一台商品化的流式细胞仪FACS I由BD公司和美国斯坦福大学共同研制成功 1980年北京师范大学引进了中国的第一台流式细胞仪FACS II BD是全球最大的流式细胞仪生产商和供应商，在全球的占有率为75%，在中

2、国75% 在全国各大医院和科研院所，大部分为BD公司的仪器，总计数量已超过700台， 如:清华，北大，中科院，军科院等等,BD公司流式细胞仪,FACSCalibur,L SRII,FACSCanto,FACSCount,FACSAria,流式细胞术概述,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞仪的检测

3、范围,细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体,流式细胞仪的原理,散射光信号,散射光信号,Right Angle Light Detector Cell Complexity SSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Sca

4、tter） 细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,流式细胞仪的检测信号,荧光信号 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光信号,双色直接染色,数据分析,数据存储: LIST MODE,数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图（3D Plot）等,单参数直方图分析,数据分析,直方图分析,多参数散点图分析,数据分析,等高图和密度图分析,数据分析,三维图分析,流式细胞仪的应用,流式细胞仪的临床应用,

5、HIV免疫分型，CD4绝对计数 淋巴细胞亚群分析 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的免疫状态监测 干细胞计数 阵发性血红蛋白尿 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病,流式细胞仪的科研应用,免疫功能研究 血小板分析（心脑血管疾病） 细胞周期和倍体分析 细胞凋亡 干细胞研究 树突细胞研究 肿瘤相关基因表达的研究 抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究 放疗/化疗疗效的研究,流式细胞仪的应用（免疫）,淋巴细胞免疫分型 淋巴细胞亚群分析 CD4绝对计数 HIV与SARS的诊断与研究 淋巴细胞CD4/CD8分析 CD4绝对计数 T细胞活化,免疫功能和免疫调

6、控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究 淋巴细胞的增殖 树突状细胞的研究,淋巴细胞亚群分析,使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（CD分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析 各淋巴细胞亚群的百分含量 淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能， 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作

7、用。,淋巴细胞亚群分析,根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为 T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+） T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+） Th/Ts 评价那些自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态,诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如AIDS） 造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B） Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常） Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等 移植后动态免疫监测： 急排临床症状出

8、现前1-5天，活化T和Th/Ts持续，1.2预示急排； Th/Ts持续表明可能感染，比值1.08，可能性大，0.2应停用免疫抑制剂； 实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察 治疗前常伴T 、Th/Ts，放/化疗有效可恢复； 淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好； 探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）,临床意义判断病人的机体免疫状态,淋巴细胞亚群双色分析,12%,76%,49%,26%,11%,AIDS 病人T亚群分析,27-51%,15-44%,50-84%,先天性无 r 球蛋白血症,5-18%,乳腺癌患者T淋巴细胞亚群变化,TriTEST/MultiTest与T淋巴细胞绝对计数,

9、使用三色试剂或四色免洗试剂 样本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL 免洗操作，减少细胞丢失 绝对计数TruCOUNT管预先加有已知数量微球，在流式细胞仪上直接得到T淋巴细胞亚群的绝对含量，提高工作效率和计数的精确度单平台计数 报告T淋巴细胞及TH、TS百分含量、绝对含量和H/S比值,TriTEST CD4/CD8/CD3分析与T淋巴细胞绝对计数,%T LymphCD3+ Abs Cnt CD3+CD4+ %T LymphCD3+CD4+ Abs Cnt CD3+CD8+ %T LymphCD3+CD8+ Abs Cnt T H/S Ratio,MultiTEST CD3/CD8/CD45/C

10、D4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,淋巴细胞活化功能研究,T淋巴细胞活化,细胞数目增殖 细胞表面表达活化标记 分泌细胞因子,CFSE失踪原理,羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。 体内、体外实验均可以应用,Dilution of CFSE with

11、cell division,Lyons and Parish, 1994 JIM, 171;131,Divisions: 3 2 1 0,CFSE FL-1 (Log),Divisions: 3 2 1 0,葡萄球菌肠毒素刺激牛时间变化示意图，,T淋巴细胞活化,细胞数目增殖 细胞表面表达活化标记 分泌细胞因子,T细胞激活抗原表达的动力学曲线,FastImmune Assay System快速全面检测淋巴细胞功能,BD FastImmune Activation System快速免疫活化检测系统,BD FastImmune Activation System快速免疫活化检测系统,应用实例：HIV

12、病例T细胞活化检测,淋巴细胞活化功能检测的广泛应用,结合淋巴细胞亚群分析 免疫调节: 病因学研究: AIDS、感染、肿瘤、自身免疫性疾病 药物筛选/疫苗疗效评价 各种状态下免疫状态评价：移植、寄生虫、营养失调、创伤、手术、烧伤、放/化疗等,T细胞的细胞因子分型,型介导细胞免疫反应 引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调 刺激来源：病毒、某些细菌 型介导体液免疫反应 引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调 刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源,活化的淋巴细胞分泌细胞因子,BD FastImmune Cytokine System快速免疫细胞因子检测系统,Activation 37 I

13、ncubation,Intracellular Stain,Lyse/Fix,Acqusition,Permeabilize,lymphocyte,erythrocyte,stimulus,Surface Stain,Wash,cytokine,Wash,Wash,protein blocking,基于细胞水平的研究 胞内因子 胞外因子,BD FastImmune Cytokine System快速免疫细胞因子检测系统,应用实例：分析1型与2型免疫反应,CytometricBeads Array (CBA)系统胞外细胞因子检测系统,简介,CBA是一系列荧光强度不同、包被有捕获抗体的微球，类似于

14、ELISA的捕获孔板，可以捕获相应的抗原，再结合第二种荧光检测抗体，形成一种双抗体夹心结构，能结合上，就能发出荧光来，从而检测到相应的抗原。 简而言之，将包被有不同抗体的微球混合在一个样本中即可进行多参数检测。 应用领域：主要用于血清、血浆、培养细胞上清、眼泪或房水等各种液相中可溶性细胞因子的浓度检测 细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析,How to analyze soluble proteins in FCM?,+,+,待分析的可溶性抗原,荧光标记的检测抗体,捕获微球,捕获抗体,Bead,微球体标记技术MDC(blue) Different percentage and ratio

15、 of PDC and MDCin 3 samplesMDC role in cancer and cell immunity scatter properties of MDC in 3 samples: larger in ascites and undergoing apoptosis in LN,DC与HIV,The Journal of Immunology, 2002, 168: 47964801.,PDC,MDC-,PhosFlow -Phospho-proteins Detection by Flow Cytometry流式蛋白磷酸化检测,细胞间和细胞内的信号调节,胞间信号 胞

16、内信号 细胞因子、趋化因子、 细胞因子受体、趋化因子受体和生长 生长因子等 因子受体等的下游信号,磷酸化/去磷酸化分子调控点,在细胞的多重信号传导路中，许多蛋白和酶的活性都受控于酪氨酸tyrosine、丝氨酸serine和苏氨酸threonine的磷酸化 蛋白的磷酸化/去磷酸化是一个可逆的过程：即在蛋白激酶的催化作用下向上述氨基酸位点添加磷酸集团，而在蛋白磷酸酶的水解作用下移除磷酸集团 磷酸化/去磷酸化参与增殖、分化、发育、凋亡、压力反应等的调控 异常调控见于：如糖尿病（II型，胰岛素受体Ser/Thr磷酸化）、炎症（P38 Kinase）、血管新生（Tie-2受体和VEGF受体Tyr磷酸化）

17、、肿瘤、心血管疾病、高血压、中风、神经系统疾病等,JAK/STAT Signaling Pathway: STAT Phosphorylation and Translocation,NUCLEUS,IL-4,IL-4R,细胞膜,膜外,膜内,磷酸化蛋白的检测,Method: Immunohistochemistry（免疫组化） Western blot Flow cytometry BD PhosFlow Cells: Intracellular staining of phosphorylated proteins In combination with surface markers Us

18、ing Phospho-Specific antibody,P,P,Y,Y,Y,Y,Nonphosphorylation “specific” antibodies Detect the total protein: unphosphorylated + phosphorylated isoforms Antigen: recombinant protein fragments Phospho-Specific antibodies Detect defined phospho-epitopes of phosphorylated isoform Antigen: Synthetic phos

19、pho-peptides,Y,磷酸化和非磷酸化抗体的区别,Y,BD PhosFlow和Western blot的比较,P.O. Krutzik et al. / Clinical Immunology 110 (2004) 206221,Western blot 群体细胞分析 需要同源性样本 单参数分析 检测需要大量的细胞106 需批量检测，耗时耗力,BD PhosFlow 单细胞水平进行分析 可以检测异源性样本 （结合细胞表面抗体） 在单细胞水平同时进行多参数分析（多色抗体） 只需要很少的细胞103-104 快速，省时省力，而且可以在96孔板中完成实验（配备96孔板自动上样装置）,A the

20、oretical experiment comparing Western blot and flow cytometry with three samples and a protein of interest at 1, 10, or 50 copies per cell. Sample 2 and 3 look the same via Western blot, but when stained with fluorescently labeled antibodies, the differences between the samples become more relevant.

21、,BD PhosFlow和Western blot的比较,P.O. Krutzik et al. / Clinical Immunology 110 (2004) 206221,流式检测蛋白活性结果与Western Blot比较,不仅可以研究某个传导路中的某个特定磷酸化蛋白的活化 还可同时研究多个传导路中的多个磷酸化事件,BD PhosFlow,磷酸化蛋白胞内染色流程,刺激 Stimulate cytokine、LPS脂多糖或内毒素、PMA佛波酯、etc （option）溶血全血或实体组织 固定 Fix Paraformaldehyde多聚甲醛 破膜 Permeabilize methanol

22、 or detergent-based甲醇/去垢剂 染色 Stain simultaneously stained for surface marker and phospho-proteins using phospho-specific Abs 分析 Analyze,Permeabilize,Stain,Fix,Analyze,Application Sample show,Using Phospho-Specific antibody in cells In human lysed whole blood 减少样本处理的操作步骤，同时减少人为处理导致的细胞活化，更复合体内环境 In hu

23、man PBMCs In activated cell lines In animal tissue cells In diseases Using Phospho-CBA/CBA Flex set in cell lysates,Intracellular Staining Of STAT3/STAT6 In IL-4+IL-6 Stimulated Whole Blood,Human whole blood was either untreated (A) or stimulated with IL-6 + IL-4 (B), 100 ng/ml each for 15 minutes a

24、t 37. The cells were then fixed using Patented BD Phosflow Lyse/Fix Buffer for 10 minutes at 37, and followed by Perm Buffer III for 30 minutes on ice. Then cells were stained with intracellular phospho-proteins & Surface marker Abs.,肿瘤相关基因表达的研究,肿瘤基因表达产物的检测,恶性肿瘤是一种多基因异常疾病。由于原癌基因的激活或抑癌基因的突变、失活或缺失，导致某

25、些细胞分化不良和增殖失控而形成肿瘤。 FCM利用特异性的抗癌基因/抑癌基因表达产物（特异性蛋白质）的单克隆抗体对癌基因的表达蛋白进行检测，监测癌基因与抗癌基因表达在肿瘤发生发展中的作用，从分子水平推动了恶性肿瘤的发生机制及调控因素的研究进程。,肿瘤基因表达产物的检测,癌基因与抑癌基因： myc基因族（C-myc, N-myc, L-myc）： 癌基因，高表达促使转化细胞恶性繁殖进入肿瘤临床期 ras基因族（N-ras, K-ras, H-ras）： 癌基因，编码蛋白为 P21，在乳腺癌、胃癌中表现为P21蛋白过度表达 P53：抑癌基因，可抑制ras基因和myc基因协同作用引起的细胞转化，许多恶

26、性肿瘤都有P53基因的缺失或点突变 c-erbB2基因：又称neu基因，在癌细胞表面常有表达，表达产物为HER-2/neu，其过量表达与肿瘤的发生、复发转移及预后不良有关,121,结肠癌患者不同组织中突变型P53表达,外周血（3.2%）,转移淋巴结（71.91%）,原发灶（88.45%）,122,Bcl-2与病理分级,结肠癌高分化（18.11%）,结肠癌中分化（73.49%）,结肠癌低分化（79.33%）,123,CD44V6与肿瘤转移,胃癌原发灶（14.52%）,胃癌转移淋巴结（28.51%）,胃癌远处转移（94.28%）,细胞凋亡,细胞凋亡的分析,细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 细胞凋

27、亡的主要检查手段 形态学检查 DNA Ladders实验 流式细胞仪检查 与凋亡相关的病理过程（HIV、自身免疫性疾病、肿瘤） 研究凋亡调控因素如癌基因、细胞因子及药物等对凋亡的影响,凋亡检测-每一步都有检测试剂盒,细胞凋亡检测,凋亡相关细胞膜变化的检测 凋亡相关线粒体变化的检测 凋亡相关酶活性的检测 凋亡相关DNA片段的检测 凋亡相关基因蛋白的检测,细胞膜变化的检测早期凋亡,磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，DNA不断裂 线粒体膜电位变化的检测 细胞内氧化还原状态改变的检测,细胞膜变化的检测,磷脂酰丝氨酸（PS）的检测早期凋亡,早期凋亡PS检测及结果判断,早期凋亡特征 磷脂膜（PS）外翻，但是细胞膜

28、保持完整性，因此PI染色为阴性 DNA没有发生断裂 结果判定 早期凋亡：AnnexinV+/PI- 死亡或者晚期凋亡： AnnexinV+/PI+ 正常的活细胞： AnnexinV-/PI-,ANNEXIN-V/PI检测,132,ANNEXIN-V/PI检测,control,处理16h后,处理24h后,线粒体水平检测相关产品,线粒体膜电位的检测 BD Mitoscreen（JC-1）Cat# 551302 25tests 原理：荧光染料JC-1在活细胞中以聚体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光，在凋亡细胞中，以单体形式存在不与线粒体结合而产生绿色荧光。 操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测,JC-1 检测结果流式图,凋亡相关酶活性的检测,背景知识 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶） Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的组分裂解 Caspase 3激活=细胞凋亡 检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的caspase活性。,CBA分析凋亡信号通路,DE