高级微生物-2原核生物

1、,第二讲 原核生物的分子细胞学,原核生物的描述和定义 Chatton（1937）根据细胞结构将所有生物分为两大类群： 真核生物（eukaryotes） 细胞由膜包围的核和细胞器组成 原核生物（prokaryotes） 无核膜与细胞器,原核生物细胞结构的三个特点： 基因载体是由分散细胞中的染色体(双链DNA)组成 缺乏由单元膜隔开的细胞器 核糖体为70S型，而不是真核生物的80S型,原核细胞和真核细胞的区别,真核细胞,原核细胞,一般构造：细胞壁、细胞膜、细胞质、质粒、核质体、核糖体等，是所有细菌都有的构造 特殊构造：鞭毛、菌毛、性菌毛、荚膜和芽孢等，并非所有细菌都有的构造,细菌的细胞结构,Fig

2、ure Schematic diagram of a typical procaryotic cell. Minimally, a procaryote is composed of a cell wall and plasma membrane that surrounds its cytoplasm containing a chromosome, ribosomes, enzymes, several classes of RNA, and small molecules (precursors).,共有组分 肽聚糖 特有组分 G 磷壁酸 G 脂多糖,细胞壁是位于菌体的外层，内侧紧贴细胞

3、膜的一层无色透明，坚韧而有弹性的结构。细胞壁约占细胞干重的10%25%。,一 细菌与古菌的细胞壁,G+ cell wall,G- cell wall,cell wall: Gram Positive,注： L：脂磷壁酸 T：磷壁酸（质）,磷壁酸teichoic acid（垣酸）,占壁干重4050%。是以磷酸多元醇分子的重复结构单位为主链（骨架）的阴离子多聚物。在多数情况下，磷壁酸分子中的磷酸多元醇是磷酸甘油，或磷酸核糖醇，因此，根据主链组成不同可以将磷壁酸分为两大类：,磷酸甘油型磷壁酸 核糖醇型磷壁酸,根据结合部位的不同分为： 壁磷壁酸: 含量多，通过共价键与肽聚糖分子结合,并延伸到肽聚糖分子

4、表面, 带有负电荷。 膜磷壁酸:与菌细胞原生质膜的脂类结合。,磷壁酸的功能,协助肽聚糖加固细胞壁； 增强细胞膜的稳定性； 提高膜结合酶的能力(使细胞壁形成负电荷环境,以利于 吸附镁离子,维持酶活)； 构成噬菌体的吸附位点; 形成表面抗原决定簇的主要成分。 保证革兰氏阳性致病菌（如A族链球菌）与其寄主间的粘连,cell wall: Gram Negative,注：o：o特异侧链；P：通道蛋白；B：Braum脂蛋白 L：脂多糖,又称“外壁”。是G-细菌细胞壁所特有的结构，位于G-细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和若干种外膜蛋白质组成。,外膜 (outer membrane),外膜,肽聚糖,脂多糖,脂

5、蛋白,磷脂,蛋白质,孔蛋白,脂多糖 = 糖基O-侧链核心多聚糖类脂A,脂多糖的化学组成,脂多糖(LPS)的结构与主要功能,O-特异侧链是LPS抗原决定基，其结构的多样性决定了G-细菌细胞表面抗原决定簇的多样性。,沙门氏菌属的抗原型多达2107种,一般都源自O-特异侧链种类的变化。这种多变性是革兰氏阴性细菌躲避宿主免疫系统攻击，保持感染成功的重要手段。,核心多糖组成恒定，具有带电荷的糖基和磷酸基团，是细胞表面负电荷来源。与磷壁酸相似，也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞表面浓度的作用，对细胞膜结构起稳定作用。此外，也是噬菌体特异吸附位点。,类脂A是G-细菌致病物质内毒素的物质基础。,

6、18,外膜蛋白(outer membrane protein),嵌合在LPS和磷脂层外膜上的蛋白。有20余种，但多数功能尚不清楚。, 孔蛋白（porins）,是由三个相同分子量（36000）蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白，中间有一直径约1 nm的孔道，通过孔的开、闭，可对进入外膜层的物质进行选择。,非特异性孔蛋白：可通过分子量小 于800-900的任何亲水性分子。,特异性孔蛋白：只容许一种或少数 几种相关物质通过，如维生素 B12和核苷酸等。,孔蛋白,是一种通过共价键使外膜层牢固地连接在肽聚糖内壁层上的蛋白，分子量约为7200。,脂蛋白(lipoprotein),脂蛋白,又称壁膜间隙，呈胶状

7、。 在G+细菌一般指细胞 壁与细胞膜之间的狭窄空间，在G-细菌一般指细胞 壁外膜与细胞膜之间的空间。,周质空间(periplasmic space, periplasm),在周质空间中，存在着多种周质蛋白（包括水解酶类、合成酶类、运输蛋白、结合蛋白和受体蛋白等）。是进出细胞物质的中转站和反应场所。,LPS层的主要功能,构成某些革兰氏阴性细菌致病物质内毒素的物质基础； 有细菌自我保护作用，它可以阻止溶菌酶、抗生素和染料等侵入菌体，也可以阻止周质空间中的酶外漏； 作为重要的抗原因子决定了革兰氏阴性菌抗原的多样性； 是许多噬菌体吸附的受体。,肽聚糖由 N乙酰胞壁酸(NAM） +-1,4糖苷键 N乙酰

8、葡糖胺（NAG） 短肽链（主要是四肽）组成的亚单位聚合而成的大分子聚合物。,细胞壁的基本骨架肽聚糖（共有成分）,肽聚糖网格状结构,NAG 与 NAM 残基以-1,4糖苷键交替连接，形成聚糖的骨架（主链）； 一组相同的短肽侧链接于NAM上； 相连主链上的短肽侧链通过一条肽桥、或直接相连，从而形成网状分子结构。,G+菌肽聚糖单体,G菌肽聚糖单体,肽聚糖的特点:,1) 为原核生物所特有(古菌例外) 2) D-型氨基酸和DAP （二氨基庚二酸）在真核细胞中未发现 3) 个别菌中DAP可为Lys代替,溶菌酶对细胞壁的作用,可切断NAM和NAG之间的1，4糖苷键，引起细菌裂解。 对G菌，在EDTA存在下，

9、受溶菌酶作用。 溶菌酶处理后的菌细胞应保存在弱高渗（0.1 -0.2M）蔗糖液中。,青霉素对细菌细胞壁的作用,Penicillium可与转肽酶结合，而使该酶失活，抑制了侧链末端的丙氨酸与五肽桥的连接，破坏了细菌细胞壁的完整性（即抑制肽聚糖的合成），因此，Penicillium仅对正在生长着的细菌有作用。,金黄色葡萄球菌(G+细菌),大肠杆菌(G-细菌),青霉素,溶菌酶,细胞壁与革兰氏染色,G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。,G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，

10、缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。,有G 、 G之分, 没有肽聚糖结构，所有古菌都对溶菌酶和青霉素类的内酰胺抗生素不敏感。 如甲烷细菌（Methanobacteria）， G ，细胞壁含有假胞壁质N乙酰塔罗粘酸，肽链中的氨基酸是L型，糖苷键是1，3连接。,古菌的细胞壁,S-层(Surface layer),由蛋白质在菌体表面自装配为规则晶格的单分子表面层（S-层），与菌体以非共价方式连接。S-层作为菌体面对环境的最外层屏障，具有保护、分子筛、维持菌体形状、细胞识别和黏附、毒力因子等功能，是菌体适应周围环境的重要结构。 已发现400多种古菌和细菌有S-层蛋白质（Bt 、Ba

11、、乳酸菌等）。 因其基因的可操作性，独特的自装配特性及其单分子晶体层的结构都很有应用前景，目前已经应用在异源蛋白质的分泌性表达、表面展示和纳米科技等方面。,S-layer,An electron micrograph of the S-layer of Deinococcus radiodurans,S-layer,Transmission electron micrograph of a freeze-etched, metal shadowed preparation of a bacterial cell with an S-layer with hexagonal lattice（六角

12、点阵）symmetry. Bar, 100nm,S-layer,G+ , G- and Achaea have S-layer S-layer is composed of protein or glycoprotein , it may protect the cell against ion and pH fluctuations, osmotic stress, enzymes, or the predacious（食肉的） bacterium. S-layer helps maintain the shape. S-layer seems to protect some pathoge

13、ns against complement attack and phagocytosis(吞噬作用).,S-layer,We create S-layer fusion proteins with the specific protein functionality you desire: Antibodies 、Antigens 、Markers 、Receptors ，Etc.,二 细菌的染色体与质粒,细菌DNA：长度：一般为：13mm。例：大肠杆菌的DNA长约1mm。生长迅速的细菌在核分裂之后细胞往往来不及分裂,所以细胞中常有24个核，而生长缓慢的细菌细胞中一般只有12个核，不在染色体

14、复制时期一般是单倍体。,由大型环状双链DNA纤丝不规则地折叠或缠绕而构成的无核膜、核仁的区域。,类核体(nuclear body; nucleoid),The Bacterial Nucleoid,Examples of nucleoid structure and distribution in Sulfolobus cells.,Micrograph of a bacterium showing the nucleoid region (green) within the cytoplasm where the bacterial chromosome occurs,The bacteri

15、al chromosome is a circular DNA macromolecule except in Streptomyces where it is linear and Rhodobacter sphaffoides （红杆菌）, which has two separate chromosomes.,Bacterial chromosome,The bacterial chromosome is usually a single covalently（共价的） closed circular molecule.,The term nucleoid is used to desc

16、ribe aggregated DNA in the prokaryotic cell.,The bacterial chromosome and supercoiling:,cccDNA,ocDNA,lDNA,Electron micrograph of an isolated nucleoid released from E.coli.,Example of E. coli cell,There are over 50 supercoiled domain in the E.coli chromosome. The total amount of DNA is about 4600 kb.

17、 If the total DNA is opened and linearized, it would be 1 mm in length. The the cell is only about 2-3 um long. So to package this much DNA into the cell requires that the DNA be highly supercoiled.,质粒(plasmid),细菌染色体外的共价闭合环状双链DNA分子分子量约为-100 106 D.携带1-100个基因, 一个菌细胞可有一至数十个质粒。,Structure of a bacterium

18、highlighting the bacterial plasmid.,提取所有胞内DNA后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点， 如抗药性初步判断。,特定的质粒提取方法和后处理使染色体和RNA均被除掉。,3. 质粒的检测,质粒的特点：,1、可以在细胞质中独立于染色体之外（即以游离状态）存在，也可以插入到染色体上以附加体的形式存在； 2、在细胞分裂时，可以不依赖于细菌染色体而独立进行自我复制，也可以插入到细菌染色体中与染色体一道进行复制； 不同质粒DNA 根据质粒拷贝数的不同，分为严紧型和松弛型，前者与宿主的繁殖结合，致使每个细胞仅有一个或几个

19、拷贝质粒，而后者却是由质粒自己编码基因合成的功能蛋白所调节，在宿主染色体复制停止的情况下，质粒可以继续扩增，因而具有10200 个拷贝数。,3、质粒可以通过转化、转导、或接合作用而由一个细胞转移到另一个细胞，使两个细胞都成为带有质粒的细胞； 4、质粒对于细胞生存并不是必要的。 质粒上一般含有几个到几百个基因，质粒编码细菌各种重要的生物学性状。如控制着细菌的抗药性、固氮、抗生素生成、毒素、颜色等性状。质粒可自行丢失与消除。质粒并非细菌生命活动不可缺少的遗传物质，质粒自行丢失或经紫外线等理化因素处理后消除后，质粒所赋予细菌的性状亦随之消失，但细菌仍存活。,5、每种细菌，甚至同种细菌的不同个体所含质

20、粒的种类和数目都可能不同。如肠道杆菌，不少菌株含有F质粒、col质粒；产肠毒素大肠杆菌还具有耐热肠毒素质粒，而其他肠道杆菌不具备。 质粒决定宿主的因素有三： 质粒间致育力的相互影响。 有质粒的细菌表面产生排斥其他质粒进入的排斥力。 质粒在宿主细菌内竞争同一复制点，结果未占用复制点的质粒不能复制，便随细菌的分裂而消失。 质粒的不相容性(plasmid incompatibility) 有些质粒不能共存于一个细菌的细胞，这种特征称为质粒的不相容性，共存于同一种细菌中的质粒必须属于不同的不相容群。,质粒的种类,在细菌中有很多不同的质粒，不同的细菌含有不同的质粒。质粒根据它们所带有的基因以及赋于宿主细

21、胞的特点可以分为五种不同的类型： 1、抗性质粒（Resistance（R）plasmids） 2、致育因子（Fertility（F）plasmids） 3、Col质粒（Colicins plasmids ） 4、降解质粒 (Degradative plasmids) 5、侵入性质粒(Virulence plasmids),F质粒 又称F因子、致育因子。带F因子的细菌能产生性菌毛。有性菌毛的细菌称为雄性菌（F+菌），无性菌毛的细菌称为雌性菌（F-菌）。F+菌于F-菌配对接合时，F+菌能通过性菌毛，将遗传物质（如R因子）传递给F-菌，从而使得后者获得F+菌的某些遗传性征。细菌的耐药性即可通过这种方

22、式传播，成为某些细菌易产生耐药性的原因之一。,抗性（R）质粒 它们带有抗性基因，可使宿主菌对某些抗菌素产生抗性，如对氨基苄青霉素，氯霉素等产生抗性。R质粒还可以通过感染的形式在不同种的细菌中传播，60%-90%的革兰氏阴性菌的耐药性是由R因子转移的。 Col质粒 带有编码大肠杆菌素（colicins）的基因。大肠杆菌素可杀死其它细菌。如E.coli中的ColE1。,降解质粒 这种质粒编码一种特殊蛋白，可使宿主菌代谢特殊的分子，如甲苯或水杨酸。 侵入性质粒 这些质粒使宿主菌具有致病的能力。如Ti质粒，是在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中发现的，其特定部位与植物核

23、内DNA组合来表达信息，使植物细胞肿瘤化。即此质粒既有在细菌中表达的基因，又有在高等植物中表达的基因。现经过加工用来作植物转基因的一种常用载体。,质粒应用 质粒的特性，使其成为遗传工程的理想载体。 一个质粒就是一个能独立复制的单位，如果把特定的DNA片段和某一质粒连接起来，并引入到宿主细菌内，该DNA片段上的基因便随着质粒的复制而复制，随细菌的分裂繁殖而大量繁殖。这些基因在细菌中表达后，最终就产生了大量的基因产物，遗传工程技术正是利用质粒的这一特性进行目的基因转移和表达的。 基因工程技术使细菌能大量产生胰岛素、干扰素、乙肝疫苗等生物制品。,质粒应用,载体质粒的组成要素1 复制起始位点Ori，

24、控制复制起始的位点。 原核生物只有一个复制 起始点。 2 标记基因，可以便于 加以检测，如Amp+ ,Kan+ 3 多克隆位点MCS 插入 外源基因片段的区域4 P/E 启动子/增强子 5 Terms 终止信号6 加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用,某些细菌生长到一定阶段或在一定环境条件下，细胞的正常生长和分裂停止，细胞内细胞质浓缩，逐步行成一个圆形、椭圆形或圆柱形的，对不良环境有较强抵抗力的特殊结构，称为芽孢。 芽孢成熟后可自行从芽孢囊中释放出来。,三 芽孢(endospore，spore),芽孢,芽孢囊,Figure. Gram stain of Bacillus anthra

25、cis,Shape,location and relative size to the spore of parent cell,在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。 产生芽孢的几个属： (Bacillus)芽孢杆菌属 (Clostridium)梭状芽孢杆菌属 (Sporosarcina)芽孢八叠球菌属,能形成芽孢的细菌种类,芽孢的结构,芽孢的外壁层厚而致密，主要成分为脂蛋白，通透性差,不易着色。 核心含有大量的DNA、RNA、蛋白质酶等物质，还含有2,6吡啶二羧酸（DPA）,DPA是芽孢特有的成分。一般以 DPACa的形式存在。 皮层主要含芽孢肽聚糖、 DP

26、ACa，皮层体积大，比较致密。 芽孢平均含水量低,约40%.,芽孢的组成和结构,芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心：,Figure . Electron micrograph of a bacterial endospore. The spore has a core wall of unique peptidoglycan surrounded by several layers, including the cortex, the spore coat and the exosporium. The dehydrated core contains the bacteria

27、l chromosome and a few ribosomes and enzymes to jump-start protein synthesis and metabolism during germination.,1、对高温、干燥、辐射、化学药物有强大的抵抗力。 2、含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易着色，折光性强。 3、芽胞内新陈代谢几乎停止，处于休眠状态，但保持潜在萌发力。 4、一个芽孢萌发只产生一个营养状态的细胞。,芽孢的特性,渗透调节皮层膨胀学说,DPA-Ca（吡啶二羧酸钙盐）学说,两种学说,芽孢衣对多价阳离子和水分 的透性很差,皮层的离子强度很高，产生 极高的渗透压去夺取

28、芽孢核心的水分，结果造成皮层的 充分膨胀。,核心部分高度失水，正是这种失水的核心才赋予芽孢具极强的耐热性。,芽孢抗热机制,芽孢的萌发,芽孢萌发包括：活化、出芽和生长三个阶段。在条件具备的情况下(芽孢萌发的必要条件：水、营养物、温度和O2),芽孢在几分钟内便可萌发，芽孢吸收了水和营养物，体积膨大，皮层破裂，长出芽管，发育成新的营养细胞，与此同时芽孢的特征消失。,芽孢的本质,既不是细菌生活周期的必经阶段，也不是细菌繁殖的一种形式，又不是对环境的消极反应，而是一种生命形式，一种独立的休眠体。,研究芽孢的意义,1、分类鉴定-一项重要的形态学指标 2、保存菌种-良好的抗逆性 3、分离菌种-休眠体 4、生

29、物杀虫Bt芽孢 5、灭菌标准-衡量各种消毒灭菌措施的主要指标,1、形态特征：周鞭(无鞭)、G+、杆状、产芽孢与晶体、H抗原、O抗原 芽孢: 不易着色，芽孢高抗逆，菌株保存方式,四、苏云菌芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis Bt）,Vegetative cell of Bacillus thuringiensis,Bt在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一个菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体称为伴胞晶体。干重可达芽孢囊的 约30%，对600多种昆虫尤其 是鳞翅目昆虫的幼虫有毒杀 作用，因此成功开发为良好 的微生物农药。,伴胞晶体（parasporal crystal）,Bacillus

30、 thuringiensis viewed by phase contrast microscopy. The vegetative cells contain endospores (phase bright) and crystals of an insecticidal protein toxin (delta endotoxin). Most cells have lysed and released the spores and toxin crystals.,Bt营养体、芽孢和晶体,Spore and parasporal crystal,spore,Crystal,Crystal

31、 diversity of B. thuringiensis,Bacillus thuringiensis spore and protein crystals,Protein crystals made by strains of Bacillus thuringiensis are toxic to certain insects and have been put to use as a biopesticide.,2、杀虫作用机理 晶体在害虫碱性中肠内融解，并在昆虫酶的作用下分解成有毒的成分内毒素（ Endotoxin ），与中肠上皮细胞特异受体结合，引起膜穿孔，毒素与芽孢进入血淋巴组

32、织，使害虫因饥饿和出现败血症而死亡。,Midgut epithelial Cell perforation,Sepsis death,Mode of action,BT致鳞翅目幼虫死亡症状,1901 Lepidopteran,1977 Dipterans,1980s Colepterans,1990s Mites, protozoa,1998 tumor cell,Activity spectrum of B.t.,nematodes,Cry l（含22亚类）、Cry2 Cry3（含4亚类） Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、 Cry8、Cry9（各含3亚类）， Cryl0、 Cry11（各含2亚类），Cryl2、Cryl3、Cryl4、Cryl5 Cyt1、Cyt2（各为1类）,晶体蛋白类型,cry4A, cry4B, cry11A, cyt1A,subsp. isrealensis,Dipterans,Meloidogyue sp.,novel toxin genes:,mites, nematodes, protozoa,cry5, cry6, cry7, cry8, cry1Ea,应用范围,(1) 蔬菜 (2) 棉花 (3) 水稻 (4) 玉米