生物制药工艺学第9章亲和纯化技术

1、1,第九章 亲和纯化技术,利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinity purification）,2,技术要点,（1）找与底物专一可逆结合的配基； （2）将配基通过共价键偶联到基质； （3）配基与底物吸附； （4）洗脱目标物。,3,亲和纯化技术,亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）,4,第一节 亲和层析(Affinity Chromatography),利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性

2、而建立的层析技术。 适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。,5,特点,经过一次处理可得到高纯度活性物质 ； 特异性强、分离效果好、分离条件温和； 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。,6,亲和吸附剂：载体配基,在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand）。 与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）。,7,一、亲和层析的原理,（1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。 （2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质. （3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。 动画,8,二、亲和层析载体,（一）、亲和层析对载体的要求

3、： （1）充分功能化，与配基进行共价连接。 （2）有较好的理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的水不溶性和亲水性。 （4）具有多孔的立体网状结构。 （5）应为大小均匀的刚性小球。,9,（二）、常用载体,纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体壳聚糖 (Chitosan),10,1、纤维素,纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。 非特异性吸附力较强，空间位阻。 主要用于分离与核酸有关的物质。,11,2、琼脂糖凝胶,琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。 保

4、持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 Sepharose CL,稳定性明显增加，能在pH314中应用。,12,3、葡聚糖凝胶： 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。 4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。,13,5、多孔玻璃珠： 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基团少。 6、其它载体壳聚糖,14,壳聚糖(甲壳素和壳聚糖),15,三 、 亲和配基,配基的选择

5、 配基的浓度 配基偶联的位置 配基分子的大小 配基的类型,16,（一）、配基的选择,亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。 1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲和势），KL 在10-410-8之间。 2、配基与配体的结合应是专一的 。 3、配基应具有化学活性 。,17,亲和势KL（EL复合物的解离常数 ）,分配比: 结合酶/游离酶 阻留值: Ve/V0,18,（二）、配基的浓度,对亲和势比较低的系统（KL10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10mol/L。,19,（三）、配基偶联的位置,配基固

6、定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。 AMP-Sepharose亲和柱 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。,20,第一节 亲和层析,一、亲和层析的原理 二、亲和层析载体 三 、 亲和配基 配基的选择 配基的浓度 配基偶联的位置 配基分子的大小 配基的类型,21,（四）、配基分子的大小,选用大分子配基。 小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。,22,（五）、配基的类型,较小的有机分子或天然生物活性物质。 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配基。 特殊配基（special ligand）

7、,23,通用配基（general ligand）,用于一类物质的分离提纯。 用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基； 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时的通用配基等。,24,四、 载体的活化与偶联,糖类载体的活化与偶联 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化与偶联 用于固定化配基的凝胶衍生物,25,（一）、糖类载体活化与偶联,溴化氰活化法 高碘酸氧化法 环氧化法 甲苯磺酰氯法 双功能试剂法,26,溴化氰活化法,载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下用溴化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳酸”中间体。 在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨基或芳香族氨基的配基偶联。,2

8、7,方法,28,高碘酸氧化法,多糖载体与0.1mol/L的高碘酸钠氧化反应24小时会产生醛； 在温和条件下，醛与赖氨酸上的-NH2生成西夫碱，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基胺。,29,环氧化法,碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物； 环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。,30,甲苯磺酰氯法,甲苯磺酰氯法 在无水丙酮中进行。 优点：活化反应迅速； 偶联条件温和； 偶联效率高。,31,双功能试剂法,双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团的化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、酚、醇类等偶联。,32

9、,（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联,叠氮化法 重氮化法 (含氨基载体) 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）,33,聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法,有大量可修饰的酰胺基。 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。,34,叠氮化法,聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加1mol/L的亚硝酸，反应液搅90s； 加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。,35,重氮化法,-氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。,36,碳二亚胺缩合法,碳二亚胺为羧基活化剂。 反应中的脲衍生物可用有机

10、溶剂洗涤除去。,37,（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物,1、CNBr活化的Sepharose 4B Sepharose 4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核酸类配基。 2、AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 含有6个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基。 CH-Sepharose 4B能与含有一级氨基的配基偶联。,38,39,3、环氧活化型Sepharose 6B,由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体通过醚链形成的衍生物。 用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。,40,4、活化型亲和胶10

11、和15,由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有利于碱性或中性蛋白偶联； Affi-Gel15为15个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷，故有利于酸性蛋白的偶联。,41,5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102,CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基；,42,五、 影响吸附亲和力的几个因素,KL 配基浓度对亲和力的影响 空间障碍的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 微环

12、境的影响,43,（一）、配基浓度对亲和力的影响,为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值10。 配基浓度与亲和对解离常数相关。 对于低亲和力系统，配基浓度。,44,（二）、空间障碍的影响,空间位阻。 对于分子大的配体以及小分子配基更明显。 “手臂”，增加与载体相连配基的活动度，减轻载体的立体障碍。 常用的“手臂”多为烃链。,45,（三）、配基与载体的结合位点的影响,多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂具有较大的亲和力。,46,（四）、载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。

13、 （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。,47,六、 配基与间隔臂的连接,（一）、含氮配基的连接 （二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接,48,七、 亲和层析的吸附和洗脱,影响吸附的条件 亲和层析的洗脱 亲和吸附剂的再生,49,（一）、影响吸附的条件,亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。 温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 上样体积为柱床体积的5%。,50,非专一性吸附,亲和层析中的非专一

14、性吸附。 离子效应 疏水基团 复合亲和力,51,离子效应,配基与载体-间隔臂的不完全结合，将无关离子基团引入吸附剂。 具有离子基团的亲和吸附剂会影响蛋白质的洗脱行为。,52,疏水基团,吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互吸引，形成非专一性吸附。 疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂”： （2）疏水性配基：,53,复合亲和力,离子效应作用，又有疏水作用。 配体与配基有较强生物特异性。 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高选择性。,54,（二）、亲和层析的洗脱,洗脱： 洗脱方法主要有三种： 非专一性洗脱 特殊洗脱 专一性洗脱,55,非专一性洗脱,改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化. 亲

15、和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序ClICF3COOSCN CCl3COO。 用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。,56,特殊洗脱,裂解配基与载体的连接键。 断裂方法有： 硫酯键用羟胺处理30分钟； 偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理； 二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等处理。,57,专一性洗脱,S（固定化配基），E（酶），I（游离配基） （1）竞争性效应，即ESI不如EI稳定，增加洗脱剂中I，会使E洗脱下来（正洗脱）。 （2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不影响E对S的结合，非竞争性效应。 （3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与S结合更紧密（负洗脱） 。,58,反竞

16、争性效应,59,亲和层析中常用作分离酶的配基有：,酶抑制剂 辅酶 底物 底物结构类似物,60,配基的选择和洗脱条件,61,（三）、亲和吸附剂的再生,用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由变性蛋白沉积造成，用6mol/L脲洗柱。,62,八、其他亲和层析,金属离子亲和层析 有机染料亲和层析 拟生物亲和层析（Biomimetic AFC）,63,（一）、金属螯合亲和层析,将环氧活化型Sepharose 6B与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。 金属螯合剂:亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等 .,64,蛋白质上的氨基酸残基，如组

17、氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，利于蛋白质与固定化金属离子结合。 金属离子如锌和铜。,65,吸附：pH在68。 洗脱：降低pH值、增加离子强度、或在缓冲液中加5mmol/L EDTA等方法。 特点： 蛋白质吸附容量大； 价格便宜； 具有普遍适用性。,66,（二）、有机染料亲和层析,需NAD+为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力。 染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱。 染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。,67,亲和层析,一 、原理 二 、亲和层析载体 三 、亲和配基 四 、载体的活化与偶联 五 、影响吸附亲和力的因素 六 、配基与间隔臂的连接 七 、亲和层析的吸附和洗脱

18、八、其他亲和层析,68,第二节 其他亲和纯化技术,一、亲和过滤（膜分离） 二、亲和分配（双水相萃取） 三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 四、亲和沉淀（沉淀分级） 五、亲和电泳（电泳）,69,一、 亲和过滤（Affinity Filtration）,将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括亲和错流过滤和亲和膜分离。 亲和错流过滤（affinity Cross Flow Filtration,ACFF）: 亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。,70,亲和错流过滤 （affinity Cross Flow Filtration）,基质及

19、大分子亲和配基 基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆的吸附，形成复合体； 用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。,71,基质,聚丙烯酰胺 菌类的完整细胞 （酵母、芽胞杆菌、链球菌等细胞） 琼脂糖、脂质体等,酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白A,72,亲和膜 （affinity membrane）,亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。 将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。,73,亲和膜优点,传质阻力小，达到吸附平衡的时间短； 配基利用率高，配基用量低

20、； 压降小，流速快； 设备体积小。,74,二、亲和萃取 （Affinity extraction）,定义：利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取，在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。 PEG/Dextran, PEG/无机盐,75,mA目标分子的亲和分配系数 T和B分别表示上相和下相； mA和m O为有、无配基时目标分子的分配系数； m L为配基的分配系数； CL为配基浓度； Kd为配基与目标分子反应的解离常数。 上相配基浓度CLT越高，m A越大,76,亲和萃取纯化过程,亲和分配（进料）， 杂蛋白反萃取（清洗） 目标产

21、物反萃取（洗脱）。,77,三、亲和反胶团萃取（Affinity-based reversed micellar extraction）,定义：指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂（cosurfactant）； 通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配。,78,亲和反胶团萃取过程,79,反萃取,80,四、亲和沉淀 （Affinity precipitation）,亲和沉淀:是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的生物大分子的分离纯化技术。 一次作用亲和沉淀 二次作用亲和沉淀,81,一次作用亲和沉淀,水溶性化合物分子上偶联有两个或两个以上的亲和配基 双配基（bis-ligand）；多配基（polyligand）。 双配基或多配基与含有两个以上亲和结合部位的多价蛋白质产生亲和交联，增大为较大的交联网络而沉淀。,82,二次作用亲和沉淀,制备亲和沉淀介质:利用在物理场改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基。 亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。 离心或过滤回收沉淀。 沉淀清洗后加入洗脱剂纯化目标产物。,83,可逆沉淀性聚合物 聚丙烯酰胺,84,可逆沉淀性聚合物聚合脂质体（polymerized li