肿瘤细胞与分化、凋亡(二).ppt

1、Chk2干扰后BGC823细胞96小时的OD570值,Chk1和Chk2 RNAi干扰前后BGC823细胞细胞周期的变化,Chk1干扰 24h,Chk1干扰48h,Chk2干扰 24h,Chk2干扰 48h,(Chk1Chk2) 干扰24h,(Chk1Chk2) 干扰48h,Chk1干扰24h DADS 24h,Chk1干扰48h + DADS 48h,RNAi干扰Chk1和Chk2 前后BGC823细胞周期的变化,相对灰度 1.00 1.00 1.08 1.09 0.99,Cdc25C,CDK1,相对灰度 1.00 0.88 0.34 0.56 0.93,DADS对 MGC803细胞Cdc2

2、5C、CDK1表达的影响,0h 12h 24h 36h 48h,RNA干扰MGC803细胞后CDC25C、CyclinB1表达的改变,DADS ,SiRNA: UN Chk1 Chk2,Cdc25C,CyclinB1,actin,图42 RNAi MGC803细胞Chk1和Chk2 后蛋白表达的改变,RNA干扰 BGC823细胞后CDC25C、CyclinB1表达的改变,DADS ,SiRNA: UN Chk1 Chk2,CDC25C,CyclinB1,actin,RNAi BGC823细胞Chk1和Chk2 后蛋白表达的改变,5.影响细胞内信号传导 细胞内信号传导途径主要有酪氨酸激酶受体及其

3、偶联受体途径、TGF受体途径和G蛋白偶联受体途径等，而信号分子如JAK、STATs、MAPK等是信号传导中的重要调控分子。细胞外的刺激因子均可使它们活化或者受到调控来诱发细胞内的反应，这些反应则作用于某些特定基因并调节其表达，使瘤细胞发生分化。MAPK是联系细胞表面受体与细胞内重要调节靶目标的进化保守的酶类，也对化学和物理应激做出反应，控制细胞存活与适应性。真核细胞中，已确定出4条MAPK信号转导通路，即ERK、SAPK/JNK、p38MAPK路及ERK5通路。,我们的工作表明，DADS在诱导MGC803细胞分化的过程中， MAPK三条通路起着共调节作用。DADS呈浓度依赖性抑制人胃癌细胞中磷

4、酸化ERK的表达；并且DADS +MEK抑制剂PD98059能完全阻断磷酸化ERK表达。转录因子复合物AP-1为MAPK信号通路的作用底物之一，AP-1由Jun和Fos家族成员组成，MAPK信号转导通路通过增加AP-1的含量及直接激活AP-1而影响其活性。免疫细胞化学及图像分析结果显示，对照组c-fos、c-jun表达呈强阳性，而处理组呈阴性或弱阳性，处理组光密度值较对照组明显低。,人胃癌细胞c-fos表达强阳性 SP10,处理组人胃癌细胞c-fos表达阴性 SP10,人胃癌细胞c-jun表达强阳性 SP10,处理组人胃癌细胞c-jun表达弱阳性 SP10,人胃癌细胞cyclinB1表达阴性

5、SP10,处理组cyclinB1表达阳性 SP10,DADS诱导MGC-803细胞磷酸化与总ERK表达,DADS gmL-1,0 20 25 30 35,Phospho-ERK1/2（p44/42）,Total-ERK1/2（p44/42）,DADS诱导MGC803细胞磷酸化ERK和总ERK表达的浓度依赖效应,PD98059 SB203580 DADS ,Phospho-ERK1/2（p44/42）,Total-ERK1/2（p44/42）,抑制剂作用于MGC803细胞的磷酸化ERK和总ERK的表达. The effect of inhibitors on DADS（35gmL-1） indu

6、ced expression of phospho- ERK and total- ERK in MGC803 cells.,DADS 35 gmL-1,Time/min 0 2 5 10 15 20 30 60 120,Phospho-ERK1/2（p44/42）,Total-ERK1/2（p44/42）,0 2 5 10 15 20 30 60 120 (minute),DADS诱导MGC803细胞磷酸化和总ER1/2K表达的时间效应 A. 磷酸化和总ERK1/2表达. B. 磷酸化和总ER1/2K的绝对峰值.,10-3Absolute peak area/mm2,10-3 X Absol

7、ute peak area/mm2,DADS诱导MGC-803细胞磷酸化和总p38表达 DADS呈浓度依赖性刺激p38的表达，且随着浓度递增，其促进作用逐渐增强。,DADS gmL-1,0 20 25 30 35,Phospho-p38,Total-p38,DADS诱导MGC803细胞磷酸化p38和总p38表达的浓度依赖效应,DADS 35 gmL-1,Phospho-p38,Time/min 0 2 5 10 15 20 30 60 120,Total -p38,磷酸化和总p38表达,DADS诱导的时间效应，在刺激后10-15分钟，其作用达最高峰，两小时后下降至正常。,PD98059 SB2

8、03580 DADS ,Phospho-p38,Total-p38,抑制剂作用于MGC803细胞的磷酸化p38和总p38表达.,p38抑制剂SB203580可完全阻断DADS诱导的p38的活化,0 2 5 10 15 20 30 60 120 (minute),10-3 X Absolute peak area/mm2,DADS诱导MGC803细胞磷酸化和总p38表达的时间效应。磷酸化和总p38的绝对峰值.,同时，DADS亦呈浓度依赖性刺激磷酸化JNK的表达，刺激后10-20分钟作用效果最强，两小时恢复正常。这些结果表明，ERK/AP-1抑制和p38 与JNK MAPK通路激活是DADS诱导人

9、胃癌MGC803细胞分化的重要分子机制。,DADS诱导MGC-803细胞磷酸化和总JNK表达,DADS gmL-1,Phospho-JNK1/2,0 20 25 30 35,Total-JNK1/2,DADS诱导MGC803细胞磷酸化JNK和总JNK表达的浓度依赖效应,DADS 35 gmL-1,Phospho-JNK1/2,Time/min 0 2 5 10 15 20 30 60 120,Total-JNK1/2,磷酸化和总JNK1/2表达,0 2 5 10 15 20 30 60 120 （ minute）,DADS诱导MGC803细胞磷酸化JNK1/2表达的时间效应。 磷酸化和总JNK

10、的光密度绝对峰值,10-3 X Absolute peak area/mm2,DADS和JAKs/STATs信号传导通路抑制剂AG490均可诱导HL-60细胞向成熟粒系分化，Western blot检测JAK1、STAT3的酪氨酸激酶发生了磷酸化改变；免疫细胞化学示STAT3与c-myc基因蛋白核内表达下降, c-jun, c-fos基因蛋白核内表达上升。,Stat3蛋白表达,未处理组 DADS处理组,DADS对HL-60细胞增殖分化相关基因蛋白表达的影响,未处理组 DADS处理组,c-myc蛋白表达,未处理组 DADS处理组,c-fos蛋白表达,c-jun 蛋白表达,未处理组 DADS处理组

11、,0 0.625 1.25 2.5 ATRA AG490,phospho-Jak1/stat3,total- Jak1/stat3,Phosphate and total protein changes of Jak1/stat3 after HL-60 cells treated by DADS for 3 days,7.抑制端粒酶活性 端粒酶能维持真核生物染色体的功能和稳定性，它在人胚细胞、多数肿瘤组织和永生细胞中具有活性，而在大多数成熟的体细胞和组织中只有极低或者无端粒酶活性。端粒是由蛋白和DNA简单重复序列构成，位于染色体末端以防止真核生物染色体异常结合或降解。当细胞端粒缩短到不再能维

12、持染色体稳定时，细胞就会衰老死亡，但在不死细胞系则表现有端粒酶活性，以端粒RNA为模板合成DNA，维持染色体端粒的稳定，从而细胞得以“永生”。,Leslie用RA、TPA、DMSO诱导HL60细胞分化过程中，端粒酶活性显著下降，而诱导剂直接作用于未处理组细胞时端粒酶活性不受影响，提示端粒酶活性的抑制是具有分化特异性；同时TPA和RA有诱导凋亡效应而DMSO没有此效应，在这两种情况下对端粒酶活性测定时，端粒酶活性的缺失并不是由于细胞凋亡引起的；同时，端粒酶RNA的表达量也没有改变。因此，HL60细胞的终末分化过程中伴随端粒酶的活性缺失。,存在着亟待解决的问题： (1)诱导剂本身的毒性作用。 长期

13、应用维甲酸可导致肝、骨髓和神经系统的毒性作用以及RA综合症，寻找新型诱导剂是今后研究的方向。 (2)分化诱导剂的耐药性问题。 长期使用分化诱导剂存在耐药性问题，如RA的耐药现象，因而这个问题亟需解决。 (3)实体瘤诱导分化治疗的困难。 实体瘤因肿瘤的立体形状、间质成分、血液供应不均等，很难达到真正意义的分化治疗目的。 (4)分化诱导剂作用机理复杂多样。 分化诱导剂种类繁多，作用各不相同，难以找到共有的作用途径，而且瘤细胞具有异质性和对药物的敏感性不同，其作用机理研究难度则更大。,总之，以分化诱导剂调控细胞分化与增殖代表了肿瘤治疗的新方向，尽管困难重重，随着生命科学的发展，其前景仍很广阔，而且多

14、种治疗方法的合并运用，已取得了经验，维甲酸综合治疗APL就是一个范例，诱导肿瘤细胞分化研究的进一步深入，定会为人类防治癌症作出更大的贡献。,细胞凋亡与肿瘤 凋亡（apoptosis）是由体内外某些因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动性死亡方式，又称程序性细胞死亡（programmed cell death）。细胞凋亡在生物胚胎发生、器官形成发育、成熟细胞新旧交替、激素依赖性生理退化以及免疫性疾病具有重要意义。 在肿瘤发生发展过程中，由于调控凋亡基因发生变化，则出现凋亡受阻，细胞增多，导致肿瘤发生。,凋亡与坏死的区别,凋亡 坏死,基因调控的程序化细胞死亡主动进行（自杀性），耗能,意外事故性细胞死亡，被动进行（他杀性），不耗能,生理性刺激因子可诱导 多为散在的单个细胞,细胞固缩、核染色质边聚，细胞 膜及各细胞器膜完整，膜可发泡，形成凋亡小体,早期DNA规律降解为180-200bp片段，琼脂凝胶电泳呈特征性梯带状,不引起炎症反应和修复再生，但凋亡小体可被邻近细胞吞噬,病理性刺激因子诱导发生 多为连续的大片细胞,细胞肿胀，核染色质絮状或边聚，细胞膜和细胞器膜溶解破