不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

1、生化和分子生物学技术、中山医学院生化和分子生物学教研室、不连续聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳、一、不连续聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳的实验操作和注意事项、实验组(每一人一组，每组制备凝胶)为试剂(试剂和吸管号码、定量器的使用) 的封管分离胶调制和凝胶注入(浓度为6灌高78 cm )正丁醇封入3mm (方法、高度、界面变化观察和凝固判定、时间把握25min )、注意事项： 1、封管严重、漏液防止。 2 .垂直固定玻璃管，防止破裂。 3 .各组配合1份橡胶，试剂和移液器配合，正确添加量。 4、配合后立即注入凝胶(用滴定管注入凝胶，使用后立即清洗) 5、沿管壁逐渐添加正丁醇、浓缩凝胶的配制(浓度为3% )、光

2、聚合、各组的总体积为8ml、凝胶的高度为1.5cm、留有1cm的间隙地加入样品2 .配合胶水后立即加入胶水(用滴下管) 3，加入胶水后立即清洗滴下管，防止胶水凝固在管中。 4 .撕裂封口膜，将玻璃管固定在阳离子电泳槽(垂直、防止泄漏) 5，加入电极缓冲液(注意液面)，加入buffer样品进行处理，加入样品(20ul )阳离子电泳(6mA/管，在距离底部1cm处停止)进行剥离利用物质的两个差异来分离物质，电荷差异、电荷性质、电荷数量、分子大小、分子形状、电泳分离蛋白质原理， 蛋白质两性解离和等电点溶液pH与蛋白质PI对蛋白质电荷性质与数量决定不同蛋白质分子大小与分子形状差异的实验室常用阳离子电泳

3、方法(按介质区分)、纸阳离子电泳冰乙酸纤维膜阳离子电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳、 原生聚丙烯酰胺凝胶为单体亚克力酰胺(acrylamide，简称Acr )和交联剂n，N-甲水冷机双亚克力酰胺(n，nmethylene-即n，n，n四甲基乙亚胺(n，n，n )， Ntetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED )和催化过硫酸铵(ammonium per sulfate (NH4 ) 2s2o8c 17 h20 o6 n4 )的作用下使交联为三次元网状结构的凝胶聚合，以该凝胶为支撑体的阳离子电泳聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳(1)在一定浓度下凝胶透明，有弹性，

4、机械性能好；(2)化学性能稳定，不与被分离物发生化学反应，不溶于很多溶剂；(3)对ph和温度变化稳定；(4)几乎没有吸附和电渗析作用，Acr纯度高，如果操作条件一致， (5)样品难以扩散且使用量少，其灵敏度可以调节为10-6g (6)凝胶孔径，根据被分离物的分子量选择适当的浓度，通过改变单体和交联剂的浓度来调节凝胶的孔径(7)极限分辨率高，特别是因此，具有比醋酯纤维薄膜阳离子电泳、琼脂糖凝胶电泳等高的极限分辨率。 凝胶浓度(t )的选择与被分离物质分子量密切相关。分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(% )蛋白质10420-30-410415-20-5104-110510-15

5、1105-105105-5核酸(rna )。现在常用的是圆盘阳离子电泳(图1 )和板状阳离子电泳(图2 ) 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中阳离子电泳时，其迁移率取决于其所具有的净电荷和分子的大小和形状等因素。 如果加入试剂以消除电荷因素，电泳淌度取决于分子的大小，可以利用阳离子电泳技术测定蛋白质的分子量。 1967年，Shapiro等人发现了负络离子污染清除剂十烷基硫酸钠(SDS )有此作用。 向蛋白质溶液中添加一盏茶量的SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可以还原蛋白质分子中的二硫键。 十二烷基硫酸根带负电，各蛋白质的SDS复合体都带有相同密度的负电荷，其量大大超过蛋白质分子原的电荷量，隐蔽不同蛋白质之间的

6、本来电荷差，SDS与蛋白质结合后，引起结构变化， 蛋白质SDS复合物是约18A，其形成与“雪茄烟”的形状接近的长椭圆棒，形成不同蛋白质的SDS复合物，因为此类蛋白质SDS复合物在凝胶中的迁移率取决于分子量的大小，而不受蛋白质原本的电荷或形状的影响、SDS-PAGE、三、聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳、聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白原理、不连续聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳三种不连续聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳三种效果，凝胶孔径缓冲液pH缓冲液络离子成分、浓缩效果电荷效应分子筛效果、Gly -、Cl-、Cl-、 Cl-、Pro -、Pro -、Pro -、Gly -、Gly -、ph8.9的阳离子电泳缓冲液。 浓缩浆为AP催化聚合的宏命令多孔浆，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。 分离胶为AP催化聚合的节流孔空间，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。 电极缓冲液为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成凝胶孔径、pH值、缓冲液络离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要原因。 样品浓缩效果(1)凝胶孔径不连续性： (2)缓冲系络离子成分和pH值不连续性pH6.7的凝胶缓冲系统中前体络离子或快速络离子： HC1解离出的氯元素根(C1-)追踪络离子或慢络离子：甘