课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,专题二 微生物的培养与应用,【课题背景】,尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。 只有被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。,CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,研究思路,(一)筛选菌种,1 实例： 寻找耐高温的DNA聚合酶,PCR技术：要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,耐高温的酶,耐高温生物体,耐高温环境（热泉、火山口）,寻找,寻找,Taq细菌,启示：,寻找目的菌种时要根据它对_，到相应的环境中去寻找。,生存环境的要求,筛选原因: 因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物， 使耐热的Taq细菌保留下来。,2 实验室中微生物的

2、筛选原理,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,思考:1.该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？,碳源：葡萄糖,氮源：尿素,2.从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？,固体培养基,选择培养基,3. 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,原则上能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。,3 选择培养基：,在微生物学中，将允许_，同时_生长的培养基。,特定种类的微生物生长,抑制或阻止其他种类微生物,结果： 培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。,如何对细菌

3、进行计数？,（1）显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,400104,每个小方格酵母菌数,酵母菌细胞总数,=,稀释倍数,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,（2） 稀释涂布平板法（间接计数）,101,102,103,104,105,106,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，即一个

4、菌落代表原先的一个单细胞。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,原理：,(二)统计菌落数目,方法：运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。,原理：1个菌落1个活菌,选择菌落数在30300的平板上计数。 需培养计算出三个或三个以上的平板菌落,求平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,注意事项：,讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板） 第二位同学：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,(三)设置对照实验,阅读课本 “（三）设置对照”一段讨论教材中提出的问题。,设置对照的目的：,排除实验组中非测试因素对试验结果

5、的影响，提高实验结果的可信度。,(1)A同学出现此结果的可能原因？,土样不同 培养基污染 (或混入了其他的含氮物质),(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？,这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验。,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明_；如果结果不同，则证明A同学存在_。,A无误,培养基的配制有问题,实验流程：,样品稀释涂布平板,微生物的培养与观察,菌落计数,实验设计,土壤取样,制备培养基,（一）土

6、壤取样,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,（二）制备培养基,制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,（三）样品稀释涂布平板,稀释倍数为 101 106。每个稀释度均用3个选择培养基 和1个蛋白胨培养基。,（四）微生物的培养与观察,在

7、菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。,菌落,菌落,一无菌操作 1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好标记 注明培养基种

8、类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 三制定计划,操作提示,结果分析与评价,1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。 牛肉膏培养基的菌落数目多于选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,2.获得某一稀释度下，菌落数30300的平板，在这一稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？,相接近，说明操作成功。,课题延伸,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培

9、养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。,本课题知识小结:,巩固练习,1.使用选择培养基的目的是（ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别,C,2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是 ( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,D,3.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多,B,4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（） A.较多的氮源物质 B.