修饰标记引物的介绍.pptx

1、推荐将改性引物介绍、保存条件、冷冻干燥引物和液体稀释后的引物保存在-20C. HEX、TET和FAM中对光敏。 请保存在阴暗表兄弟处或用橘红色的管道保存。 建议放入黑盒子中染料暴露光下半寿期(约) hex 4.5 hours tet 2.25 hours fam 1.125 hours hex和Tet标识牌的寡聚核苷酸在PCR 30循环内稳定。 但是在不利的环境(高PH、高温)下，TET比HEX稳定。 稀释方法对于非Cy系荧光标识牌引物，推荐用TE稀释，浓度高于10uM。 由Cy3和Cy5标识牌的引物在碱条件下容易分解，在中性溶液溶解。 稳定性、冻干的引物在-20C下可稳定1年。 4度可以稳定

2、几个月。 积液在-20C时至少稳定6个月，在4度时稳定数周。 AP偶联引物-放入AP储藏液中运输，储藏4度，可稳定12个月。 HRP偶联引物-放入HRP贮藏液中运输，4度贮藏，可稳定12个月。 修饰对OD值的影响，一些荧光化学基在260 nm处也有吸收光：的修饰： FAM、Fluorescein、HEX、TAMRA、and TET。 虽然其他260 nm处可能有吸收值，但由于数据没有公开，因此在订正运算时不包含在内。 AP and HRP耦合的寡聚核苷酸：蛋白和核苷酸都有OD值，但可能不影响寡聚核苷酸的真实OD值。 合成规模和精制方式、合成规模为25nnol时，合成寡聚核苷酸不能为10bp以上

3、。 问题：这个表和网站上的不一致，现在在中国不论合成规模，能合成小于10bp的寡聚核苷酸吗？生物，生物修饰能耐热和pH (加热到100度，可以暴露在pH2-10中)。 也许能够承受其他极端的环境，但是还没有检测出来。 还原剂可能对生物素修饰没有影响，但没有精确数据。 生物素寡聚核苷酸在OD260中进行定量(生物素在260中不吸收光)。 生物素化的DNA成功地转化为像DH5那样的细菌。 5-生物素比3-生物素稳定，因为没有相邻的烃化学基。 3-生物素的化学结构可以预测，3-Biotin有1个期限，2个寡聚核苷酸溶解在碱缓冲液中等，有可能暴露在碱环境中。 这是因为3-Biotin具有与RNA结构相

4、似的邻接烃化学基。5生物学、3生物学、稳定性依次为3-NH23-PO43-BIO。 3生物素修饰引物的长度不得超过99个核苷酸。 由于3 -生物素是以CPG修饰的形式提供的(连接至固体支持体)，因此该系统将3 -生物素连接至序列中最后的核苷酸。 生物素dT :生物素dT是将生物素连接至dT盐化学基上，因此只有5盐化学基为t时，才能使用生物素dT。 生物素，问题：生物素dT的分子式？ 5和3生物素修饰的合成过程(合成后、合成前)？ 用什么样的连结结合来连结到寡聚核苷酸？ 与寡聚核苷酸的哪个位置(戊糖、盐化学基)相连？ 最终与寡核酸相连的形状是，生物素、若丹明、若丹明溶于水和TE的颜色是大头针色，

5、稍微紫色。 罗丹明修饰不限于合成规模，是合成后修饰。 需要额外的精制。 注：该数据是染料溶解在甲醇中测定的。 溶解于水和TE中，与寡聚核苷酸结合后的值发生变化。 罗丹明、问题：目前中国地辖区能够合成的罗丹明修饰为5Rhodamine Green、5Rhodamine Red、5Rhodamine Red、3Rhodamine Red。红色，绿色溶解在水或TE中的颜色？ 5和3修饰时的Rhodamine Green、Rhodamine Red的分子结构式？ 5和3修饰的方法：接戊糖和盐化学基的哪一个？用什么样的化学键连接？ 都是合成后修饰吗？ 合成后修饰：底漆从固体介质解离后纯化修饰，还是底漆合

6、成后直接修饰固体介质？ 修饰之前需要精制吗？ 修饰后需要精制吗？ 最终与寡核酸相连的形式为5 HEX、TET or 6-FAM、hexis4、7、2457hexachlorofluorescein、TET is 274,7、7、7、tetrachlorofluorescein hex and Tet为合成循环这些个通过磷酸二酯类化合物键的共价键结合到5末端的最后一个糖环。 液体中的颜色： HEX为大头针，FAM为黄色，TET为橘红色，这些个修饰的寡聚核苷酸不能进行硫磷氧化修饰。HEX、TET or 6-FAM、注：摩尔消光系数用最大nm以下的激光进行了测定。 由于pH和成分的微小变化可能影响上

7、述数据，因此染料的颜色依赖于ABI设备上的“过滤烟嘴设备”: dyesfilterafilterbhexgreen (560 nm ) yellow (560 nm )6- fam blue ()的3HEX、TET or 6-FAM 连接牛鼻子是什么？ 3HEX、TET or 6-FAM是合成后修饰吗？ 3HEX、TET or 6-FAM可以进行硫磷酸化修饰吗？ 5和3的修饰的不同，如稳定性等？ 最终与寡核酸相连的形式是，HEX、TET or 6-FAM、磷酸化、5磷酸化作用，通过b氰乙基化学反应被添加到引线5末端的糖环中，而不是最后的盐化学基。 什么？ 什么？ 由于三磷酸盐与固体支持介质连接

8、，在合成的第一个循环中盐化学基结合。 阻止多聚酶的伸长。 稳定性：假设DNA:3-PO4比3-BIO稳定。 3-BIO在碱性环境下脱落，但3-PO4不脱落。 用凝胶纯化磷酸化引物时，不能区分全长引物和n-1引物。 磷酸化学基具有阴性电荷，因此对阳离子电泳有影响。 用HPLC纯化的磷酸化寡聚核苷酸中，真空离心蒸发浓缩后有“污染”和微黄。 这可能是因为这种产物是综合产物。 在进行QC时，能够通过乙醇沉淀而除去。 问题： 3磷酸化的结构式？ 连接牛鼻子是什么？ 5磷酸化和3磷酸化的稳定性有什么区别？ 5限定的连线牛鼻子？ 最终与寡聚核苷酸相连的形状是？磷酸化、Aminolinker、5Aminoli

9、nker(C6 )在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过b氰乙基化学反应添加到引物5的糖环中，未添加到最后的盐化学基中。 5氨基化学基的标准耦合效率为95%，氨基化学基为260nm，没有吸光值的210nm处有吸光值。 在阳离子电泳中不能检测出其存在(阿加里肌肉凝胶和亚克力酰胺)。 3Aminolinker(C7)仅与FAM、HEX、TET、Fluorescein、Biotin、Amine、and phosphate等5种修饰兼容。 其他5修饰(Alexa dyes等)需要氨基化学基才能与寡聚核苷酸结合，免不得该染料与3氨基化学基结合。 阻止连接和多聚酶伸长的一般思维方法为末端双重脱氧法，但该

10、方法价格昂贵或无法使用。 因为根据应用程序除去3或5即可，所以只要用3或5的氨基化学基修饰就能满足需要。 另外氨基修饰是最简单廉价的方法。 可以是任意氨基修饰。 5末端C6型效果更好。 用化学交联剂可以连接双链DNA和肽。 可以尝试用叔胺修饰的DNA和戊二醛的交联。问题：5amino链路器(c 12 )、5 amino链路器(c6)、3 amino链路器(c7)、dt c6- amino链路器、3Amino /Amine链路器(c7)和3Amino /Amine的修饰过程？ 核苷酸的哪里连接？ dt c6- amino链接器的修饰过程？ 这个修饰只能用5端吗？ 对这些个的氨基修饰有什么不同？

11、Aminolinker，Alexa，它们都是通过C6连接臂与寡聚核苷酸连接的。 3端通过氨基化学基将Alexa连接到引物的3端。 Alexa fluor染料在合成后添加到寡聚核苷酸链中。 什么？ 什么？ 什么？ 问： 5和3 Alexa Fluor的结构式？ 5和3 Alexa Fluor是用什么样的结合和寡聚核苷酸连接的，是戊糖还是盐化学基？ 5和3 Alexa Fluor的合成工艺：合成前修饰还是合成后修饰5和3 Alexa Fluor有什么区别？ Alexa Fluor、Texas Red-X、修饰化学基是如何添加到寡聚核苷酸中的？ 首先在DNA的5末端磷酸化学基中加入氨基化学基，然后在

12、氨基化学基中连接带有羧基化学基的化学基。 5-COOH-NH2-PO3-DNA问题：5Texas Red-X、3Texas Red-X的结构式。 合成过程？ 合成前修饰还是合成后修饰？ 5Texas Red-X和3Texas Red-X通过什么样的耦合和寡聚核苷酸连接？ 戊糖还是盐化学基？ 水溶液的颜色？ 5Texas Red-X、3Texas Red-X的区别是Phospothioate(S-oligos )、S-oligos是寡聚核苷酸中的一元酸间的磷酸二酯类化合物键之一的氧用硫代替形成的。 此修饰在连接时进行(不是在合成后进行)。 添加盐化学基后，进行连接修饰。 两个盐化学基之间的磷酸可

13、以取代通常的双键“o”(碘元素溶液)而转换为双键“s(beaucage试剂)。 最终合成的寡聚核苷酸不是单个立体结构，而是r和s的立体异构体的混合物。 这种修饰也可以是与磷酸二酯类化合物结合相关的盐化学基。 从固体支持体解离时，3末端盐化学基变成OH，所以不能进行硫磷氧化。 可以修饰5个S-oligo。 例如，客户可以客制化S-oligo的萤光素标记。 不能在“正常”保存其他盐化学基的状态下，对某一位置的盐化学基进行硫磷氧化。 这不是化学合成的问题，而是法定的原因。 S-oligo和通常的寡聚核苷酸在糨糊上的位置相同。 用HPLC纯化法纯化硫磷氧化修饰寡聚核苷酸时，带状双峰或带状较宽。Phos

14、pothioate(S-oligos )、Phospothioate的特性：化学稳定，在水溶液中稳定，能抵抗核酸酶的应用：磷酸硫的反义引物在体内受到了许多不同的反应历程的作用。 在RNA水平可以抑制逆转录活性(抑制核糖核酸病毒复制)。 作为激活RNase H活性的基质的S-ODNs和RNA形成双链，RNase H容易切断RNA。 反义寡聚核苷酸也可以直接干扰转录，抑制翻译。 存在于细胞球内和血液/培养基中的node酶对S-Oligos基本没有影响。 由于S-ODNs保持着寡聚核苷酸的带电状态，可以通过与阳离子脂质形成复合体进入细胞球。 存在这些个的转染率也低的问题。 反义引物在mRNA中的作用

15、部位不同时，反义引物的作用也不同(例如，寡聚核苷酸和mRNA上的转录起始密码子互补，淘汰制效果好)。Phospothioate(S-oligos )、反义S-ODNS的概要/设定修正提案：典型的尺寸范围： 14-30 mers.(很多文献使用20 mers的S-ODNS。 质量范围是5000-11000。 浓度范围(培养基中) : 15-25 uM (浓度大于该范围时，会引起S-ODNS的非特异性毒性)。 脂质中介变量感受态时的浓度范围： 0.1-5 uM。 (寡聚核苷酸的最佳浓度应该根据每个细胞系和目标分子来决定)注射微量时的S-ODN的量： 0.03-1 ug/ul体内注射时的S-ODN的

16、量： 0.05-1 mg S-ODN/Kg体重。 磷酸硫键的数目：通常，很多文献都是在每个盐化学基上形成磷酸硫键。 推荐纯化方式为：脱盐或HPLC或多重HPLC (反相和阴络离子交换HPLC )。 大多数参考资料采用HPLC纯化引物用于反义引物的研究。有的参考文献比较了HPLC和脱盐精制的寡聚核苷酸，但没有差异。 问题： Phosphorthioate (A/C/G/T )、Phospothioate(S-oligos )、5 -甲醛、5 -醛修饰用化学制剂属于芳香族。 含有苯环；分子量为245。 问题：合成过程？ 合成前修饰还是合成后修饰？ 和寡聚核苷酸的什么样的化学基有联系？ 连线牛鼻子是

17、什么？ 5Acrydite，5-Acryl修饰寡聚核苷酸可以使寡聚核苷酸与多甲基乙烯凝胶发生共聚反应。 与奇异阵列互补的寡聚核苷酸包括在凝胶中的一个或更多个区域。 包含互补序列的片断通过这些个区域时被捕获。 该修饰的寡聚核苷酸用于突然变异检测、爱沙尼亚克朗筛选、样品制备和浓缩及诊断。 问题：5Acrydite分子结构？ 5Acrydite合成工艺？ 和寡聚核苷酸的什么样的化学基有联系？ 连接牛鼻子是什么？ 5-Thio-MODifier C6 S-S、巯基化学基修饰的结构是， HO-C6-S-S-C6-PO3-oligo在使用前用DTT切断巯基化学基，然后脱盐后，将连接的寡聚核苷酸溶解在100nM pH7.5体积900 ul的磷酸缓冲液中加入100ulDTT，室温下孵育1h。 用脱盐的方法除去DTT和从寡聚核苷酸脱离的保护化学基。 用缓冲液预先平衡NAP-10柱中加入1 mL的样品，用客户希望的缓冲液1.5 mL溶出。 马上用于连接。 问题： 5标题修改器c 6、3标题c 3和3标题c3s-s的结构式。 5热修改器c6s-s、5热修改器c 6、3热c 3和3热c3s-s的合成过程。 与寡