高效液相色谱分析

1、第十章高效液相色谱分析，第一节概述第二节基本原理第三节固定相和流动相第四节高效液相色谱第五节定性定量分析，第一节高效液相色谱概述，与经典液相色谱比较，并根据高效液相色谱的特性固定相进行划分。吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；大小排斥色谱(凝胶渗透色谱)。包括Tswett在内的早期液相色谱在直径为15厘米、长度为50500厘米的玻璃柱上进行。填充的固定相粒子的直径在150200m范围内，以确保恒定的柱流速。但是流速仍然很低(1ML/分钟)，分析时间仍然很长！第一节高效液相色谱总结说，压力增加流速(真空或空气泵)时，分析时间减少，但支柱托盘高度Hmin也相应增加！或者柱子效果下降了。发现为了解决

2、分析时间和柱效果问题，最有效地提高柱效果的唯一方法是减少填充物的粒子大小(310 m)！直到20世纪60年代，在高压下工作的液压设备、高效固定相和高灵敏度检测器的出现和发展，彻底解决了分析时间和柱效应问题。所谓的高效率液晶频谱技术，才能真正广泛应用。第1节高效液相色谱法频谱概述，1 .高性能液相色谱与经典液相色谱频谱方法的比较高速：HPLC采用高压液相设备，流速大大增加，分析速度非常快，只需几分钟。经典的方法是用重力加载完成一次分析需要几个小时。高效：填充物颗粒很细，很有规律，固定相斑点均匀，传导阻力小，因此支柱效果很高。几分钟内就能完成数百种物质的分离。高灵敏度：探测器灵敏度高：UV10-9

3、g，荧光探测器10-11g。高效液相色谱与经典液体(柱)色谱的比较，第一节高效液相色谱概述，第二节。HPLC和GC的比较分析对象和范围：GC分析仅限于气体和低沸点稳定化合物，牙齿物质占有机物总量的20%。HPLC可以分析高沸点、高聚合物的稳定或不稳定的化合物，这种物质占有机物总数的80%。第一节高效液相色谱法概述，流动相选择：GC采用的流动相是有限的几种茄子“惰性”气体，只有搬运作用，分组作用较小。HPLC有很多机会选择液体或各种液体的混合。除了搬运作用外，还可以与组作用和固定相对组的作用竞争。也就是说，流动相对分离的贡献很大，可以通过溶剂控制和改善分离。工作温度：GC需要高温。HPLC通常在

4、室温下进行。第一节高效液相色谱法概述了高效液相色谱的分类，第一节高效液相色谱概述了高效液相色谱的应用范围和局限性，应用范围高沸点不挥发，热不稳定性容易分解，分子量大、极性不同的有机物、生物活性物质及天然产物、化工产品及环境污染物等。方法限制：使用多种溶剂，成本高，容易产生污染。梯度比基色波更复杂的节目温度上升复杂，缺乏分析各种沸腾石油产品的通用检测器，不能替代基色谱法，也不能替代中低压液相色谱法，尤其是容易受到压力的生物活性样品。第二节基本原理1，柱内扩张，是由于频谱柱内各种因素造成的。根据气相频谱速度理论，范氏方程概述了影响周效的各种力学因素，并可修正范氏方程，用于高效液相色谱。，第2节基本

5、原理1，柱内扩张，1。旋涡扩散，不规则系数填充，填充物粒子的平均直径，第二节基本原理1，柱内扩张，2。纵向扩散，组分子的流动相扩散系数，流动相线速度，第二节基本原理1，柱内扩张3。传导阻力(1)流动中的传导阻力(Hm) (2)滞留流动中的传导阻力(Hsm)，第二节基本原理1，支柱内的宽度，(3)固定床(液体)内的传导阻力(Hs)柱，第三节固定液体-固色频谱固色相液-固色相用固色相，大部分是具有吸附活性的吸附剂，常用于硅、氧化铝、聚合物多孔微球、分子筛等。如果可以按结构和形状划分：外壳：以实心玻璃珠子为基础，将硅、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等多孔活性材料复盖在气体表面。表面多孔固定相的颗

6、粒大(容易安装的支柱)，多孔层厚度小，孔浅(渗透性好，出峰快)。但是更换容量小。适用于常规分离分析。全孔：全部硅或氧化铝粒子聚集在一起，粒子非常细，因此孔径小，传导快，柱效率高。特别适用于复杂混合物的分离。3节固定相和流动相1，固定相1)多孔：聚苯乙烯二乙烯苯交联，分微孔型，大孔型。交换台的多交换容量大，稳定。但是溶解容易，传导慢，柱效率低，分析速度慢。2)表面多孔：薄膜型=惰性核树脂薄层(1-2m)多孔=惰性核硅微球树脂薄层。克服了多孔离子交换树脂的不足，但更换容量低，柱子容易超载。3)离子交换结合相：利用化学反应将离子交换基团连接到惰性载体表面。托架可以是薄壳球或多孔硅粒子。使用后者作为载

7、体，可以得到性能稳定、耐压、柱效率高的柱。2 .液-液色谱固定相液-液色谱固定相由载体和固定相组成。原则上，GC使用的固定床也可以用于HPLC。根据涂抹方法，可以将固定床分为机器渍型和化学结合型，后者应用更广泛。1)机械涂层固定床：将固定液用机械混合涂在表面多孔(0.5-1.5%涂布量)或整个多孔载体(5-10%涂布量)上制成的液相色谱固定床。牙齿固定相的最大缺点是固定液容易流失，分离稳定性和再现性差，不适合梯度浸出。为了减少固定液的损失，通常在柱前添加与分析柱相同，但含量更高的固定液，以便在流化床进入分析柱前预先饱和固定液的短前柱。2)化学键固定相化学键固定相通过化学反应将有机分子结合在载体

8、表面形成的柱充填剂，具有稳定、低损耗、适合梯度浸出的特点。牙齿固定相分离机制不是简单的吸附或单一的液体分布，而是两者。化学键的表面覆盖决定了哪些机制起主要作用。在大多数粘接上，分配机制占主导地位。第三节固定相和流动相1，固定相，化学键相形成必须有两个茄子条件。1.载体表面必须有某种活性基团。2.固定液必须有能引起载体表面和化学反应的官能团。三节固定相和流动相1，固定相，通常化学结合相载体是硅(表面有硅):三节固定相和流动相，固定相，Si-O-R:对热不稳定、水发生、乙醇等强极性的水解Si-R(或Si)但是使用的形式反应不方便。水溶液用作流动相时，其pH值必须在4 8之间。Si-O-Si-R:不

9、水解，热稳定性好，在pH28范围内稳定在水中。与第三节固定相和流动相1、固定相、第三节固定相和流动相1、固定相、第三节固定相和流动相2、流动相、GC流不同，HPLC流动相还作为溶剂搬运，与固定一样参与组竞争，因此溶剂的选择是正确的，理想溶剂必须具有以下特点：1.如果不能与固定互溶，固定床将丢失，柱的保留特性将发生变化。2.如果需要与检测器匹配使用UV检测器，溶剂截止波长必须小于测量波长。使用折射率探测器，溶剂的折射率与要测量的物体的折射率大不相同。3节固定相和流动相2，流动相，3。溶剂的纯度要高。否则，基线不稳定或出现杂峰，截止波长可能会增加。固定床的化学反应化学稳定性不好。适当的粘度太高，柱

10、压力增加。太低容易产生泡沫。第三节固定相和流动相2，流动相，流动相选择(1)溶剂的极性(2)流动相选择原则，第三节固定相和流动相2，流动相，溶出方法(1)永久性溶剂溶出方法(2)梯度溶出；1.当正色谱法移动上的极性小于固定上的极性时，可以叫牙齿系统正色谱。2.反色补法流动上的极性大于固定上的极性时，可以说牙齿系统是反色补法。三节固定相和流动相3，正色谱和反色谱，反色谱法的特点：(1)柱寿命(2)流动相灵活性选择(3)应用范围很广，三节固定相和流动相3，正色谱和反色谱，四节高效液相色谱样品系统分离系统测试系统也具有梯度2)脱气：氦脱气加热回流法真空脱气法超声波脱气法在线真空脱气法，3)高压泵：对

11、液化泵的要求： (1)高输出压力(2)输液压力必须恒定。无脉动(3)流量稳定(4)流量调节范围必须很大。四节高效液相色谱法系统1，高压液液系统，液泵类型：恒压型和恒流型降压泵(类似于风箱)能快速获得高压，适合柱的骨池充电。但是，泵腔体积大，往复推进时会发生脉动，输出流量随颜色频谱系统阻力(主要是柱填充物)而变化，使用较少。4节高效液相色谱法1，高压水液系统，恒流型溶剂流量恒定，与柱充无关，常用。机器注射式和机器往返式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵。因为每分钟往返25100次，所以脉动很小。4节高效液相色谱系统1，高压水液系统，4)梯度淋滤装置：在分离过程中逐步改变由移动相组成的装置的装置。

12、如果只有一个泵，则可以使用低压混合设计(以一定比例混合两个或多个溶剂，然后从高压泵输出)。如果有两个以上的泵，调节各自的流量，在高压下混合。四节高效液相色谱法1，高压液相系统，梯度浸出装置，外部梯度：利用两个高压液化泵将两个茄子极性的溶剂以一定比例送到梯度混合室，混合后进入色谱。通过内部梯度：高压泵、比例调节阀，将两个或多个极性溶剂按一定比例放入高压泵中搅拌。，示例系统的HPLC柱比GC短得多，因此柱本身产生的峰值宽度相对较小。也就是说，HPLC的扩展大部分是由某些柱外部因素引起的。这些因素包括样品系统、连接的管道和探测器的死亡体积。4节高效液相色谱法2，样品系统，样品装置用两个茄子： 1)隔

13、膜注射：使用微量注射器注射。装置简单，死体积小。但是样品杨怡小，再现性差。2)高压注入阀：目前最常用的阀是六向阀。样品注入量可由样品管控制，因此注入准确，重复性好，第四节高效液相色谱法2，样品系统，高压样品阀：目前最常用的阀门为6缸阀。(David aser，Northern Exposure(美国电视电视剧)，样品量可以由样品管控制，因此注射准确，重复性好。像画一样。4节高效液相色谱法测定2，样品系统，柱材料和规格：内壁抛光的不锈钢管。通常，直管、标准填充柱的内径为4.6mm或3.9mm，长度为1050 cm。柱连接方法：柱连接通过过滤器连接到颜色频谱柱。柱充填方法：干法、湿法、第4节高效液

14、相色谱法3、色观柱、1)对色观柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱节点的砂体尽可能小。支柱长度大部分为1530厘米，内径为45毫米(尺寸排除频谱柱通常大于5毫米，频谱柱内径更大)。2)柱填充：主要采用均匀化方法。根据使用均质试剂的性质，4节高效液相色谱法3、色谱仪、平衡密度法：即使溶剂密度和填充粒子密度相似，牙齿点的粒子沉降速度也为0牙齿。常用的均质试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷。非平衡密度法：采用CC4、CH3OH、丙酮、二氧化杂环、THF等高粘度试剂时。第4节高效液相色谱法3，色谱柱，填充方法：充电时，用上述方法制作骨液，用流动相填充色球柱和延长管，将骨浆液倒入骨池充电器，在高压力下迅

15、速注入色宝柱。需要填充速度(防止冷凝、沉淀或结块)和无空气流入(影响填充均匀性)牙齿。第4节高效液相色谱法3，颜色频谱柱，按检查对象分类的整体特性检测器：折射指数检测器(RID)，电导检测器(CD)溶质特性检测器：紫外线吸收检测器(UVD)，荧光检测器(FLD)相容性分类的可选检测器，第4节，4节高效液相色谱法4，探测器，紫外线检测仪的检测原理与UV-Vis方法相同。但是，此时使用的吸收池是微量的吸收池，通常是2-10毫米，体积约为110 L。在HPLC分析中，约80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外线吸收。所以这种探测器的应用很广。4节高效液相色谱4，探测器应用最广，对大多数有机化合物反应。特征：灵敏度高。定线范围很高。流通池可以变得很小(1毫米10毫米，容积8L)。对流动中的流速和温度变化不敏感。波长选项，操作方便。可以用于渐变洗涤。选择测量波长时，溶剂必须能通过选定的光。也就是说，所选择的波长不能小于溶剂的最小使用波长。4节高效液相色谱4，检测器，高速扫描光二极管阵列(PDA)检测获得的三维色谱-频谱0，光二极管阵列检测器，紫外线检测器的重要进展