PikoReal使用培训-致病菌检测ppt课件

1、PikoReal 荧光定量PCR使用培训 致病菌检测,内容： 1、荧光定量PCR基本原理介绍 2、PikoReal 功能简介 3、致病菌检测实验操作及结果分析,PCR和定量PCR 基本知识介绍,生命的遗传物质DNA（少数物种为RNA），对于不同的物种来说，其碱基排列顺序是独一无二的 检测不同生物中特异的DNA片段，就可以清楚的区分不同的生物。,中心法则,碱基配对原则,Polymerase Chain Reaction（PCR） 聚合酶链式反应,体外的DNA 复制 PCR 反应 体外RNA 逆转录为CDNA RT- PCR 反应,通过PCR或RT-PCR反应，就可累计大量的特异性目的片段，用于下

2、游的检测和研究,Melting 94C,Primers Bind 58C,Extension 72C,PCR的基本原理,PCR的基本原理,Polymerase Chain Reaction（PCR） 聚合酶链式反应,在PCR反应过程中，升温，降温交替进行，循环往复 热循环 提供热循环环境的仪器 热循环仪（PCR仪）,Temperature,Time,Cycle 1,Cycle 2,PCR的基本原理,模板（DNA or RNA） DNA：从 animal, plant, bacteria, yeast, virus中抽提 RNA：抽提后逆转录为cDNA(也在PCR仪上完成） 引物（一对或多对）

3、脱氧核糖核苷酸 (dNTP原料) 热稳定的DNA聚合酶 Buffer （缓冲液提供适合的酶作用环境） 反应体系：5 - 50ul （常用）,PCR的基本原理,PCR 反应体系,PCR kit,PCR的基本原理,PCR实验流程图: A,模板，引物,dNTP, 缓冲液,DNA聚合酶,上样,PCR反应,PCR的基本原理,PCR实验流程图: B,PCR产物电泳，EB染色,两种产物,两对特定引物扩增的片段,多种产物,非特异性引物扩增出一系列片段,PCR实验流程图: C,PCR的基本原理,凝胶成像系统成像，定终产物浓度 半定量,PCR是当今应用最广泛的生物技术之一 几乎所有的分子生物学实验室，药物研发中心

4、，临床诊断实验室都在使用PCR技术，而且还有新的应用方向不断开发出来 几个重要的应用领域: 科学研究 医学研究及诊断 法医鉴定 食品检验,PCR应用,PCR技术的优点与缺点,缺点： 扩增与检测分开进行 繁琐 使用荧光染料EB检测DNA 有毒 不同实验室之间结果没有可比性 通量太低,扩增,检测,PCR技术的优点与缺点,缺点： 很难准确得到样本内模板DNA或RNA的量 终点的产物量不一定能如实反应和起始模板量的对应关系,相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图,PCR反应进入平台期，合成新链的原料开始不足，酶的活力也下降，导致新增DNA的量增长缓慢，最后停止增长。,荧光定量P

5、CR 基本原理 荧光染料和探针 应用介绍,光源,荧光定量PCR 基本原理,热循环仪,探测器,可以实时检测出每轮循环的PCR产物量,加入荧光染料的PCR体系,模板，引物,dNTP, 缓冲液,DNA聚合酶和荧光探针或荧光染料,在体系中原料充足的情况下，产物按固定倍数呈指数增长 指数增长期间，初始模板浓度不同的样品的扩增曲线彼此平行,同时扩增梯度稀释的同一样品（已知浓度）,扩增曲线循环数与初始模板浓度的对数值成线性关系,Cq,荧光定量PCR 基本原理,未知浓度样品,Cq = - k lg X0 + b,标准曲线：,区别： 普通PCR：可以粗略定出反应结束时终产物的量- 半定量 荧光定量PCR仪：可以

6、精确测量出初始模板量,荧光定量PCR 荧光染料和探针,非特异性的荧光染料 SYBR Green I 特异性的荧光探针 TaqMan,SYBR-Green I,非特异性荧光染料 SYBR- Green,SYBR-Green I,非特异性荧光染料 SYBR- Green,融解曲线分析（Tm）,非特异性荧光染料 SYBR- Green,Tm：50%的DNA产物解链时的温度 一种DNA片段只有一个特定的Tm，所以通过溶解曲线分析，可以检验扩增的产物是否是目的片段,Tm,非特异性荧光染料 SYBR- Green,应用列举：酵母菌检测,根据Tm值判断是否是酵母菌,Sequence Specific Pro

7、bes: Taqman probes,特异性荧光探针 Taqman probes,特异性荧光探针 Taqman probes,常用的标记探针的染料： 第一通道：FAM 第二通道：HEX 第三通道：Rox 第四通道：CY5,致病微生物： 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单核细胞增生李斯特氏杆菌 肠毒素大肠杆菌 阪崎肠杆菌 弯曲杆菌（禽类） 肉毒梭菌 志贺氏菌 小肠结肠炎耶尔森菌、 霍乱弧菌 副溶血弧菌 创伤弧菌等 均能把3-5天的检测时间缩短到一天之内,特异性荧光探针 Taqman probes,单重和多重荧光定量PCR 单通道（单色）：一个PCR管里只做一个基因定量（多用SybrGreen） 双通道

8、（两色）：一个PCR管里做两个基因的定量 多通道（多色）：一个PCR管里做三个以上基因定量,常用,FAM,HEX,PikoReal 功能简介,研发生产中心：位于芬兰Espoo,光源: 5x LED 寿命长，终身无需更换，为qPCR实验提供持续，稳定的激发信号 无需使用ROX染料进行光强校正 探测器：CCD 相机 能同时快速收集整板多重荧光信号数据 高灵敏度 PCR模块：96孔半导体PCR,PikoREAL 的硬件系统:,功能：,绝对定量,双探针法,HRM法,相对定量,基因型分析,熔解曲线分析,选配模块,五通道四色：,一个反应管里最多可同时检测4种不同的致病菌核酸,仪器特点： 1、硬件组合优越，

9、设计创新 2、更加适合5-10ul小反应体系，成倍节省实验成本 3、小巧、快速、稳定、安静无声,致病菌检测实验操作及结果分析,检测流程,25g 或25ml 样品 225ml预增菌培养液，混匀 ，适宜的温度下培养24小时,取1ml培养液，加入裂解液，裂解细菌，释放核酸（45min）,配制标准品，PCR反应液，加样（30min）,定量PCR反应，查看并分析结果（1.5h）,阴性：出结果报告,阳性：继续用培养法验证结果,两天内可出结果,OXOID 常用预增菌培养液：,赛默飞咨询热线：8008105118,1、预增菌 按说明书操作,2、细菌裂解，配制反应液及上样,1）细菌裂解：获得待测样品。 2）配制

10、标准品：阴性对照样品，阳性对照样品（4个浓度） 3）按检测样品量计算所需反应液的量 4）配制所需反应液，混合均匀 5）把反应液加入反应板，并分别在相应的孔加入阴性对照样品、阳性对照样品，待测样品。,以下操作均按照检测试剂盒操作说明书进行：,检测试剂开放，可选择各国产及进口厂家试剂盒,以金黄色葡萄球菌的检测为例,1、样品预增菌 25g 或 25ml 样品 10%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤 37度，24小时 金黄色葡萄球菌：Staphylococcus Aureus (SA),以金黄色葡萄球菌的检测为例,2、细菌裂解，样品制备 A、取1ml 培养液，13000rpm 离心2分钟 B、去上清液，加入10

11、0ul DNA提取液充分混匀 C、沸水浴加热10分钟（误差不超过1分钟） D、13000rmp 离心5分钟，上清液备用（样品）,试剂盒：Liferiver 金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（荧光法） 生产商：上海之江生物科技 货号：DD004102,3、梯度标准品配制 A、内部对照：取内部对照品4ul，加36ul水，震荡混匀后，3000rmp离心10秒，备用。 B、10倍稀释标准品（如只需出阴阳性结果，则无需配制系列浓度的阳性标准品） 1）取4只2ml离心管，分别标记为：2、3、4、5 （浓度依次为：5106 、 5105 、 5104 、 5103 拷贝/ml) 。 2）各管中分别加入36ul水

12、 3）取4ul 阳性对照品加入1号管中，震荡混匀后取4ul加入2号管，2号管震荡混匀后取4ul加入3号管。依此处理4号管。,4、反应液配制1（绝对定量法用) 计算所需各反应液成分，按下表量加入2ml离心管，震荡混合均匀 绝对定量标准品 ：5 (5个浓度，可定量出未知样品拷贝数） 阴性对照：1 未知样品：n （n为未知样品数）, 110 是指多配10，以补偿配制和加样过程中的损耗 如每个样品需要做2个或3个重复，则在各算式后再乘2或3即可,4、反应液配制1 (阴阳性判定法用) 计算所需各反应液成分，按下表量加入2ml离心管，震荡混合均匀，3000rmp离心10秒，备用。 绝对定量标准品 ：1 (

13、1个浓度，作为阳性参照） 阴性对照：1 未知样品：n （n为未知样品数）, 110 是指多配10，以补偿配制和加样过程中的损耗 如每个样品需要做2个或3个重复，则在各算式后再乘2或3即可,5、上样 A、取一片96孔Piko板，放入上样辅助仪，每孔加入反应液18ul B、取裂解的样品，加入un 孔，每种样品1孔；取稀释号的标准品，依次加入最后一列的孔中。在0孔中加入2ul水。,样品排列建议：S - 阳性标准品、0 阴性对照、un 未知样品,6、覆膜，离心，放入qPCR,7、设置程序，点击Run启动PCR反应,编程 双击桌面仪器图标，打开软件,2、点击New，新建一个运行文件，点击Protocol

14、，进入程序编辑界面,编程,选中以上各步，可以修改，添加和删除反应步骤,点击反白不需要检测的染料，输入反应体系。,编程,添加新循环,添加溶解曲线检测,上下移动或删除反应步骤,输入或输出反应程序,开始运行程序,添加一个反应步骤,添加数据采集步骤,编程,参数修改,左边选中要修改的步骤，右边相应的框中修改温度和时间 如要修改升降温速率，热盖温度，点击“Advanced Properties”,点击Run启动PCR反应,状态监控,电脑监控,随时可以点击HOME，回主界面编辑新程序，分析已有实验结果。或进入Plate Layout进行板式设置。,8、板布局,点击Plate Layout，进入板布局界面，定

15、位样品，输入名称，确定样品属性。- 程序运行前，运行中，运行结束均可进行设置和修改,告诉软件各反应孔的样品信息,板布局,输入样品名称等信息,样品分组,孔信息拷贝，删除，粘贴，取消,样品模块类型选择,板布局输入，输出,选择样品属性，分组，设重复，设标准曲线,设置复孔,板布局- 绝对定量,1、选择所用染料 2、选择样品类型为Standard 3、打开复孔和标准曲线设置向导 4、输入复孔排列模式 5、输入第一个样品浓度（如1000000） 6、从左到右拖拽选中所有标准品孔，标准曲线设置即可完成。 7、未知样品孔的设置和命名同相对定量,点击,1,2,3,4,5,6,7,绝对定量 有梯度稀释的标准品,阴阳性判定 只有一个标准品,9、结果分析,程序运行结束，Analysis 选项出现，点击进入分析界面,结果分析主界面,分析种类选项栏,显示每一次检测的荧光强度数据,显示反应曲线图,程序运行日志,绝对定量和熔解曲线分析,选中Cq,点击Absolute, 添加绝对定量标准曲线,绝