动物胚胎工程.ppt

1、动物胚胎工程、转基因动物、基因敲除动物和爱沙尼亚克朗动物建立的胚胎学基础、管敏强、温州医学院实验动物中心、第一节动物胚胎工程简介， 1 .概念2 .研究对象工程之一：胚胎移植工程之二：胚胎培养工程之三：胚胎保存工程之四：胚胎分割工程之五：试管授精工程之六：显微注射工程之七：卵子激活和孤雌发育工程之八：细胞核移植和克隆技术，第一节胚胎移植技术，本节内容一，胚胎移植技术简介二，国内外发展概况三， 胚胎移植的意义四、胚胎移植的基本原则五、胚胎移植操作程序一、概论(一)概念胚胎移植(embryo transfer，ET ) :又称受精卵移植，提供体内或体外胚胎的个体捐献者(donor )接受胚胎的个体

2、接纳体(recipient )，使捐献者排卵通常采用超排(superovulation )的国外将通常的胚胎移植称为超数排卵胚胎移植或多排卵胚胎移植(multipleovulationandembryotransfer，MOET )。 目前，体外胚胎生产(in vitro production，IVP )技术和克隆复制(cloning )技术等方法也可以生产胚胎，扩大了优质胚胎的来源，降低了ET的成本。 二、胚胎移植历史，表1哺乳动物胚胎生物技术发展的主要事件简表，2.1初期阶段1890年剑桥大学Walter Heape从纯安哥拉母兔取出2个4细胞球胚胎移植到纯比利时母兔输卵管上端(同种雄性兔

3、交配的3h )，结果4只贝贝2.2初期阶段1900-1950主要由英美科学家对兔、羊、山羊小家畜进行研究，成功率在35%左右。 2.3发展阶段1950-1970日本首次牛胚胎移植成功，随后日美非手术法移植成功。 胚胎移植成功率达70-80%，2.4实用化初期阶段1970-1980加美开始设立牛胚胎移植公司，1973年牛冷冻胚胎移植成功(英)，2.5实用化研究阶段1982-大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定克隆羊诞生。 三、胚胎移植的意义、科研用途：1.获得转基因动物、淘汰制动物和爱沙尼亚克朗动物、核移植、胚胎切割、试管授精等目的动物2 .动物微生物净化其他用途：1.珍稀动物扩大

4、群(如高产奶牛和濒危动物)2.不孕不育不育症(二)胚胎移植依从性的基本原则，(三) 开展胚胎移植的条件，1 .胚胎移植的生理学基础，2 .胚胎移植的基本原则，同一解剖位置：空间环境的整合性，同一大姨妈阶段：接纳体和供体在发情时间上的同步性，人员的技术水平和所需设备从优良品种的母畜中获得大量胚胎。 3、胚胎移植条件、五、胚胎移植技术方案、良种公畜、六、胚胎移植的基本步骤、供体的超数排卵和人工受精接纳体的同步发情胚胎的收集与评定胚胎的移植、1 .在实施超数排卵小鼠、兔和金鱼老鼠的超数排卵研究中，一只KM小鼠获得了83枚胚胎超列使用的荷尔蒙激素主要有3种。第一类是FSH (卵细胞促进荷尔蒙激素)等，

5、第二类是LH (黄体促进荷尔蒙激素)等，第三类是外源促排卵荷尔蒙激素，如GnRH等类似物和这些个荷尔蒙激素的复合制剂。 超数排卵的意义采用超数排卵可以大幅度增加每次排卵数，科学研究表明，在短时间内可获得大量卵和胚胎，满足胚胎工程研究、遗传工程研究和胚胎库的建构观需要。 在大幅缩短研究周期的生产中，可以提高优秀动物的繁殖数，提高生产量，提高经济效益。 2、利用同步发情、外因性荷尔蒙激素制剂或其他生物科学手段，人为地特罗尔和调整了一群雌性动物的动情周期进展，使其在预定时间内集中发情，并订正地合理组织配种，称之为同步发情或同步发情。 为了让雌动物发情，需要特罗尔p的浓度，特罗尔黄体的“消”，“长”是

6、特罗尔母畜发情的关键。 消：缩短黄体期PG处理长度：人为延长黄体期p处理，缩短和延长黄体期进行同步发情，缩短黄体期(PGF2)，延长黄体期(黄体酮)、正常动情周期正常黄体期和卵泡期，山羊等动物主要使用前列腺素类荷尔蒙激素的小型啮齿动物， 例如小鼠可以通过选择发情母鼠和结扎雄鼠的交配来达到同期发情的目的，称为假宫内孕母鼠，动物同期发情，3胚胎采集，(1)手术方法利用清扫液将胚胎从生殖器内飞出，收集到器皿中。 (2)非手术法、胚胎采集是胚胎移植的重要环节之一，其包括冲胚液的配置和灭菌、冲胚器械的准备、供体牛的检查和麻醉、冲胚操作等步骤。 1、冲胚液的调配和灭菌2、冲胚器械的用途和准备3、供体母畜的

7、检查和处理4、胚胎的检查和鉴定、胚胎的检查是在体视镜下从冲卵液中回收胚胎。 云同步检测胚胎的数量和质量。 将发育正常的胚胎供移植或体外培养和保存。 胚胎检查项目： 1、受精卵整体形态和体积大小2 .透明胶带形状、厚度及损伤程度3 .发育正常胚胎的卵裂球应具有整齐的外形，大小一致，分布均匀，发育速度与胚龄一致4 .卵细胞表面颗粒的状态和多少等。 表2胚胎分级标准，5 .胚胎移植、胚胎移植也有手术法和非手术法两种方式，手术法一般用于所有动物，主要用于小动物。 只适用于牛、马、笨蛋等动物，而非手术方法。 传统胚胎移植主要由以下步骤组成：1.超数排卵2 .同步发情3 .胚胎收集和预处理4 .胚胎移植，

8、以小鼠为例：1.为获得同步发情的假宫内孕母小鼠，准备结扎小鼠，通常手术治疗5周龄小鼠目的：制备同期发情的母鼠，2 .超数排卵腹腔内注射PMSG 10U，一般白天注射，间隔48注射HCG，光周期保持1214h，注射HCG的母鼠与正常雄鼠配合，第二天早晨检查阴道栓，如果看到栓已接种3、同步发情、核算时间、4 .胚胎采集和预处理(1)受精卵采集和处理在栓塞当天胚胎在1个细胞球期。 用脱颈椎法杀死母鼠，切除暴露子宫、输卵管的子宫、输卵管，放入平皿中用灭菌平皿切除输卵管，放入装有冲输卵液的集卵杯中，在立体显微镜下撕裂壶腹部，放出受精卵，用新鲜培养液清洗12次。 用玻璃酸酶催化剂处理受精卵细胞球块；(2)

9、28细胞球胚胎采集交配后2060，输卵管存在28细胞球期胚胎。此时卵丘细胞球已经脱落，可以用1ml注射器将胚胎从输卵管伞口冲走。 其基本步骤如下：取输卵管，立体显微镜下见输卵管伞口，伞口呈平截面，周围稍粗糙。 然后，用大头针定径套轻轻夹住伞口下方的部分，慢慢地将打卵针插入伞口，用大头针定径套轻轻夹住针并按下注射器，胚胎从另一端飞出。 冲洗胚胎：收集冲洗胚胎，用新鲜培养液冲洗12次，转入培养过程。 冲卵，(3)桑葚胚和囊胚采集交配后6072，部分致密8细胞球胚胎已进入子宫。 桑椹胚胎和胚胎的收集必须来自子宫。 5 .胚胎移植(1)根据输卵管移植胚胎数确定供胚胎移植的接纳体母鼠数，做好手术准备。

10、手术切口位于两侧腰部离背正中线1 cm处，左右各有相互平行的切口。小鼠麻醉、剪毛、消毒后，手术切除小鼠皮肤、肌肉，敞开腹腔，暴露卵巢、卵巢脂肪垫，用大头针定径套夹住脂肪组织，逐渐引出卵巢、输卵管和部分子宫角，通过纱布保护的切口放置于纱布.在体视显微镜下观察输卵管伞，用输卵管吸引胚胎，按石蜡油、气泡1、培养液、气泡2、胚胎(尽量携带培养液)的顺序。 气泡3，培养液。 (2)子宫移植麻醉，剪毛，消毒背部正中，最后在肋骨水平，纵向切开皮肤、腹壁，在白色脂肪体上张开小口切开腹膜，用钝大头针定径套夹住脂肪体，从切口引出，接着陆续引出卵巢、输卵管、子宫，小心转移到体视显微镜下。 用钝大头针定径套轻轻地夹在

11、子宫上端，在针尖下的子宫壁上开一个小孔。 留心不要接触血管。 保证针扎入子宫内腔。 轻轻拔出针尖，沿着这个孔插入约0.5cm的移植管，轻轻地喷射吸引管，使培养液后面的气泡到达吸引管的末端。 此时，所有胚胎已经转移到子宫内。 子宫、卵巢、输卵管挤压腹腔，复位、缝合。 大动物胚胎移植、工程2 :胚胎培养、胚胎培养、培养开始前，彻底清洗实验室和所用培养仪器，灭菌，去除可能残留的细胞球毒性物质。 培养液的组成方面，水、无机络离子、有机成分、能量物质、pH值、渗透压等对胚胎发育有很大影响。 现代培养液被分类到Whitten氏液、Brinster液、BMOC3和CZB液等单纯培养液和TCM199、CMRL

12、 1066、Ham氏液和DMEM液等复杂培养液中。 胚胎培养方法，即液滴培养法、输卵管培养法和中间接纳体培养法。 液滴培养法是用塑料大板块制作数个50l培养液的小滴，每滴添加一定数量的胚胎，然后灭菌瞄准平衡好的流动残奥翅片。 或者先将流动残奥片放入平皿中，用注射器吸入培养液和胚胎，垂直延伸至平皿底部形成小滴。 之后，将培养皿放入空气饱和大气湿度5CO2、95的37.5CO2孵化机中培养所需要的时间。 更换培养液时，在立体显微镜下用注射器或口腔特罗尔微吸管吸出培养液，加入新的培养液继续培养。 输卵管培养法是取发情动物的输卵管洗净后，放入培养皿，培养液面超过输卵管，将同种或异种动物的胚胎从伞口注入

13、输卵管进行培养。 所谓中间接纳体培养法，操作后的胚胎可以将受精卵、早期胚胎移植到同种或异种动物的胚胎中，该方法虽然没有种特异性，但为了培养后容易找到胚胎，便于胚胎保护，一般在琼脂内包埋后进行培养。 胚胎细胞球订正数法，即空气干燥法和荧光染色法。 空气干燥法是将胚胎放入1柠檬酸钠溶液中低渗透1020分钟，尽量使其不含液体，将胚胎吸在洁净的载体薄片上，用固定液固定。 空气干燥后，Giemsa染色，计数。荧光染色法广泛应用于牛、羊、火腿星空卫视、小鼠、兔、猪等胚胎订正数，常用染料为Hoechest 33342，复染液为以2.3柠檬酸钠制备的0.1或0.01台盼蓝(TB )液。embryo on Da

14、y 3 of culture、embryo on Day 5 of culture、工序3 :胚胎保存、1、常温保存2、低温保存3、异种生物保存4、冷冻保存、胚胎冷冻保存采取特殊的保护措施和降温计程仪柱，常用手工工具：冷冻管，方法：避免冰晶的形成， 破坏胚胎细胞球内结构的1 .慢速降温法2 .快速降温法(1)三阶段(2)二阶段，保护剂：甘油、1，2 -丙二醇、DMSO机器(慢速)。 此外，还可以随时复苏繁殖品系动物，在遗传理论指导下，改良品种，培育新品种和品系。 工序4 :胚胎分割、发育初期胚胎细胞球具有万能性，用适当的方法将胚胎分成两个或多个部分，每个部分具有发育为完整个体的能力，为了胚胎个

15、体卵裂球的万能性，对基因型培育同一动物进行了初步探索。 胚胎分割，1 .概念：2 .优势3360，指采用显微操作技术(采用机械方法)将早期胚胎切成几等份，移植到宫内孕母子宫，产生同卵多仔子孙的技术。 子孙有同样的遗传物质。 胚胎的数量可以加倍，使优良品种的家畜迅速繁殖。 3 .特征3360、4，所选胚胎3360发育良好，形态正常的桑椹胚或胚.胚胎分割的基本计程仪程序、分割器具的准备、胚胎预处理、胚胎分割、分割胚的培养胚胎分割前需要制作胚胎固定管和分割针，固定管末端钝圆，接近外径固定的胚胎直径切割针现在有玻璃针和微刀两种，玻璃针一般用实心玻璃拉伸，微刀用尖锐的金属刀片和微细的玻璃棒粘在一起制成。

16、 2 .胚胎预处理，为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般在链霉亲和素中进行短时间处理，使透明胶带软化、变薄、去除透明胶带。 3 .进行胚胎分割、胚胎切割时，首先将发育良好的胚胎转移到含操作液滴培养皿中，操作液常用多仙后星利特缓冲液，其后在显微镜下用切片针或切片刀将胚胎分成两半。 4 .分割胚的培养，是为了提高半胚移植的宫内孕率和胚胎利用率，将分割的半胚放入空透明带，或用琼脂包埋放入中间接纳体放入体内，或直接在体外培养。 5 .分割胚胎的保存和移植可以在胚胎分割后直接移植到接纳体，也可以进行超低温冷冻保存。 为了提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或胚阶段，冷冻。 (3)胚胎分割技术的进展，哺乳动物胚胎分割技术在近20年取得了很大的进展，主要显示了操作方法简化、效率提高的趋势。 在牛胚胎移植生产中，胚胎分割用于提高胚胎移植的总受胎率，克服异性双胎不孕不育。 此外，胚胎分割抽样用于胚胎的性别鉴定