实验11生物显微制片技术.ppt

1、实验9生物显微切片技术，综合性，12小时，实验目的和要求，1。了解石蜡切片主要步骤的基本原理。2.掌握各种试剂的制备和各种设备的使用。3.掌握石蜡切片法的具体操作方法。4.熟悉实验过程中的注意事项。5.用植物和动物材料制备标本切片。6.通过显微镜下观察鱼肝细胞染色玻片标本，了解鱼肝细胞的显微结构。生物切片技术综述。生物显微切片技术是观察和研究细胞、组织、胚胎和动物的形态、结构和病理变化的重要方法。因为生物体的器官和组织太大或太厚，无法在光学显微镜下观察，或者可以放在光学显微镜下观察，所以光不能透过，而且一些精细结构具有相同的折射率，所以即使光可以透过，它们也看不清楚。因此，有必要在显微术中使用

2、各种方法来制备载玻片样品，从而可以在光学显微镜下观察组织细胞并长期保存，并且结构对比变得明显。一般来说，它可以分为切片法和非切片法。切片方法：石蜡切片法；火棉胶切片法；冰冻切片法等。非切片法：包括整体密封法；涂层方法。压缩法，除了铺路、研磨等。微观生产需要经过一系列的操作，这些操作相当细致复杂，每一步的失误都会导致整体的失败，所以需要耐心细致，动用双手和大脑。切片法：取样、固定、洗涤、脱水、透明包埋、染色、脱水和密封。非切片法：样品经固定、清洗、脱水、染色、脱水和透明密封。与非切片法相比，切片法可以显示组织和细胞的精细结构，对比度非常明显和清晰。但是，操作步骤多，程序复杂，生产速度慢，耗时长。

3、例如，洋葱根尖纵切面的线粒体和有丝分裂的观察；小麦和玉米叶片横切中木质化细胞质和纤维素细胞质的观察。切片法是生物显微镜中最常用和最重要的方法，其中石蜡切片法最为重要。非切片法可以保持生物体或部分器官和组织的原始状态和完整性，但没有切片程序，它不仅可以清楚地显示器官和组织之间的关系，还可以显示组织和细胞之间的结构关系。在非切片方法中，整个切片方法只能切片非常小的材料，例如人口腔上皮和草履虫。涂片法仅适用于含有大量水分或完全是液体的组织或器官。1、1.1非切片法，1.1涂片法主要用于液体颗粒状物质如血液、精液、尿液、微生物液体培养物等。它不能用切片法切片，可以作为单层细胞涂在载玻片上，也可以固定、

4、脱水和染色制成永久性标本。1.2铺展法主要用于观察动植物组织的表皮。待观察的动植物组织可从活体中取出，用锋利的镊子撕下一层表皮，迅速铺在载玻片上。如：洋葱表皮细胞。1.3压片法将一些柔软的材料放在载玻片上，用小手术刀分散，加入一滴染料，用盖玻片覆盖，用拇指垂直用力挤压，将组织分散成薄片，然后观察，如通过按压植物根尖观察染色体。1.4磨盘用于硬组织，如骨骼和牙齿。1.5分离过程该方法使用化学试剂溶解间质组织并将组织分散成单个游离细胞。例如，染色体标本是通过植物去壁和低渗的方法制备的。2.切片方法。切片是用光学显微镜或电子显微镜观察动植物组织的薄片。切片法是用手或切片机将组织切成薄片来观察组织的方

5、法。有必要通过一系列步骤将一些支持物质渗透到组织中，以硬化组织进行切片。根据t2.1石蜡切片法，包括以下主要步骤：取样、固定、清洗、脱水、透明蜡浸包埋切片、脱钙、脱水、透明密封等。一般组织从材料固定到密封需要几天时间才能制成玻片标本，标本切片可以长期保存。每个环节、材料的详细步骤和要求：材料必须新鲜完整，如果储存时间过长，蛋白质会分解和变性，导致细胞自溶和细菌繁殖，避免挤压和挫伤，这不能反映体内组织的形态结构。注明采集时间、地点、名称、组织部位等。组织块的适宜尺寸为0 . 50 . 50 . 2厘米。固定化：将切好的新鲜材料用化学溶液浸泡成小块，使细胞和组织中的物质成分快速凝固或沉淀，停止细胞

6、的所有代谢过程，防止细胞自溶或组织变化，并尽可能保持细胞的结构不变。此外，固色还能使组织变硬并有助于染色。此外，还有干燥、高热和低温淬火等物理方法。洗涤和脱水：洗涤：固定的薄纸材料需要去除残留在薄纸中的固定液及其晶体沉淀，以免影响以后的染色效果。用自来水冲洗。脱水：清洗过的纸巾充满了水，需要在透明、上蜡和嵌入之前去除水分。脱水逐渐用一种既能与水混合又能与透明剂混合的液体代替样品中的游离水。脱水器通常使用乙醇或丙酮、正丁醇和叔丁醇进行梯度脱水。每次持续几个小时。脱水过程：通常从30或50%乙醇开始，一般30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，800%，100%。脱水剂的浓度不应太宽，以免引起组织强烈

7、收缩或变形。透明是用可与脱水剂(乙醇)和包埋介质(石蜡)混溶的液体代替样品中的脱水剂(乙醇)，从而为最终包埋创造有利条件。现在使用的透明剂一般是二甲苯、甲苯、氯仿、芳香沥青等。一般过程如下：1/3二甲苯-2/3乙醇混合物1/2二甲苯-1/2乙醇混合物2/3二甲苯-1/3乙醇混合物二甲苯是使用最广泛的透明剂，其渗透性强，溶蜡量大，易挥发，其缺点是容易使组织收缩、变硬、变脆。将透明步骤后的组织块浸入透明剂和石蜡的混合溶液中，逐渐增加石蜡的比例，直至组织块中的透明剂完全被石蜡替代，便于后续的包裹和切片。每个阶段应在培养箱(60，液体石蜡)中浸泡蜡1-3小时。包埋后的样品在石蜡中浸泡后，内部空间被石蜡

8、完全占据，然后需要将其包埋到具有相同硬度的石蜡块中切片。用镊子将石蜡浸泡过的组织块轻轻夹入盛有液体石蜡的纸盒中，放置好，石蜡冷却至固态后完成包埋。多个组织可以同时嵌入。此时，组织材料的预处理过程已经完成，可以用于切片。切片和修整：切片前，蜡块应修整。首先，大的蜡块应该被切割，使每个小块包含一块组织，然后修剪成立方体或长方体。组织周围石蜡的厚度与切面的厚度相等(3毫米)。固定：将修复后的蜡块粘贴在合适尺寸的样品台上(台木)，以便固定在切片机上。切片：调整切片机的刀片位置，使其与桌面上的蜡面平行。一只手拿着毛笔，另一只手转动切片机，切好的蜡块连接成一条长长的蜡条。将蜡带按要求切成几段，放在40的水

9、面上。贴片：蜡带贴在一个干净的载玻片上，上面有粘性药片(蛋白质甘油)。在恒温载物台上展平并干燥。对于脱蜡、水合和染色蜡带，必须用二甲苯除去石蜡，然后用乙醇除去二甲苯，然后在水中染色。染色方法很多，应根据标本的要求选择不同的染料。最常见的是苏木精-伊红染色核染料核中使用的染料包括天然染料，如苏木精和品红，以及合成染料，如藏红花、节紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀石绿和焦油紫。(2)细胞质中使用的细胞质染料包括曙红、亮绿、橙G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝。(3)脂质染色剂用于显示脂质的染色剂包括苏丹红三号、苏丹红四号、尼罗蓝硫酸盐和油红。该方法包括以下步骤：二甲苯1/2二甲苯1/2乙醇混

10、合物100%乙醇95%乙醇85%乙醇70%乙醇50%乙醇30%乙醇苏木精染料溶液0.01%盐酸0.01%氢氧化钠蒸馏水30%乙醇50%乙醇70%乙醇85%乙醇曙红染料溶液95%乙醇100%乙醇，3个石蜡切片实例鱼肝切片，材料：鱼肝(2-3毫米厚，肉3-4小时/包/包/泽尼克固定为试剂：固定液、苏木精染料溶液、1%曙红水溶液、1%盐酸乙醇溶液、氨水、二甲苯、300%乙醇、甘油蛋白粘片和中性胶。苏木精是一种碱性染料(含有阳离子)，而曙红是一种酸性染料。鱼肝细胞的细胞核含有酸性物质，它能很容易地与碱性染料的阳离子结合而染蓝色，而细胞质含有碱性物质，它能很容易地与酸性染料中的阴离子结合而染粉红色。实验

11、程序：样品(2-355 mm3)，固定(卡诺3-4小时，布恩12-24小时)，洗涤(70%乙醇3-5次)，脱水(80%，90%，100%乙醇各0.5小时)，透明(乙醇和二甲苯混合均匀15分钟，二甲苯混合两次15分钟)。石蜡56-60，0.5小时两次)包埋(凝固30分钟)切片(8米，涂在水面上)粘贴(粘片，滴1滴)粘贴(40-45)干燥(37，24小时)脱蜡(二甲苯2-5分钟，二甲苯乙醇2-5分钟)复水(100%，90%，80%，70%，50%，蒸馏水每2分钟)染色(杜氏苏木染料溶液15-20分钟)水洗(2.5分钟两次，共5分钟)分色)发蓝(氨水3-4秒)、水洗(两次，每次5分钟)、再染色(1%

12、曙红水溶液，每次1-5分钟)、脱水(50%持续几秒钟、70%、80%、100%乙醇，每次2分钟)、透明(乙醇二甲苯，每次5分钟、二甲苯，每次5分钟)并密封(中性树胶50)。4植物组织切片技术实例，4.1徒手切片重要的是切下一小块扁平而薄的组织，而不是完整的组织切片；握住材料或夹子(莴苣茎、胡萝卜根、泡沫塑料等)。)左手握刀(刀片或手术刀),右手握稳，用手臂力量代替手腕力量；刀片平放在展平的平面上，轻轻按压刀片，匀速平稳移动，从刀片的右侧向左侧倾斜切割，不挤压材料，不锯切；水保持在材料的切割表面和切割边缘，以防止材料变干；切片可简单染色1-2分钟，0.1%亚甲蓝，0.5%中性红，1%藏红花(木质化细胞壁和细胞核染成红色)I2-KI溶液(淀粉颗粒为蓝色，细胞核为黄色)，4.2石蜡切片(根、茎、叶)，显微镜观察，便于器官的三维重建。硬质材料可用作滑动切片机，通常也可用作手动切片机。程序：取材料(0.5-1cm3)，固定(Kano，FAA，2-24小时，如果材料有空气，需要泵送)，清洗(70%乙醇两次)，脱水(80%，90%，100%，100%乙醇各0.5小时)，透明(乙醇和二甲苯混合均匀15分钟，二甲苯混合0.5小时两次)，通过蜡(0.5)。0.5-1小时两次)，包埋(凝固30分钟)，切片(8米，摊在水