实验八酵母核糖核酸的分离及组分鉴定、DNA的Tm值测定.ppt

1、实验8:酵母核糖核酸的分离和核酸成分的鉴定。首先，目的：了解核酸的成分，掌握鉴定核酸成分的方法。第二，原理上，酵母核酸含有更多的核糖核酸。核糖核酸可溶于碱性溶液中，解聚的核糖核酸可通过向碱性提取物中加入酸性乙醇溶液而沉淀，从而获得粗核糖核酸产物。核糖核酸包含核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸。它可以通过用硫酸煮沸来水解，并且可以从水解产物中检测到上述组分的存在。3.行动1。提取：将2 g酵母悬浮在10毫升10%氯化钠溶液(50毫升锥形瓶)中，膨胀并摇匀，然后在100沸水浴中加热30分钟，然后冷却。离心(3500转/分钟)10分钟，将预冷的酸性乙醇溶液倒入等体积的上清液中。搅拌时小心倒入。核糖核酸沉淀完

2、成后，离心(3000转/分钟)5分钟。将所得沉淀物用适量0.5毫升/升碳酸氢钠溶液溶解，然后用超临界溶液将体积调节至10毫升。2.脱氧核糖核酸和核糖核酸组分的鉴定：1)取两个装有嘌呤碱的小试管，分别加入0.5毫升脱氧核糖核酸和核糖核酸样品溶液，然后向每个试管中加入0.5毫升10%氨水和0.5毫升0.1摩尔/升硝酸镧，然后观察沉淀物及其颜色变化；2)取两个装有核糖的试管，分别加入0.5毫升的脱氧核糖核酸和核糖核酸样品溶液和0.5毫升的二苯胺溶液。将其放入沸水浴中10分钟。注意溶液是否变蓝，这显示了该方法的特异性。3)磷酸：取两根试管，加入0.5毫升脱氧核糖核酸和核糖核酸样品溶液和0.5毫升磷酸盐

3、固定剂。在水浴中加热，观察溶液是否变蓝，指示磷酸是否存在，以及为什么两个试管的颜色深度不同。第四，思考问题，p43第3、6、7页，实验9，DNA Tm值的测定，第一，目的，正确理解DNA Tm值的定义和测定Tm值的意义；掌握DNA Tm值的测定方法；了解脱氧核糖核酸变性和复性的机制和条件。原理：当脱氧核糖核酸在稀盐溶液中加热到80-100时，双螺旋结构将会分裂，两条链将会分开形成不规则的线圈。同时，一系列物理和化学性质发生了变化，其中260纳米处的消光值增加(颜色增强效应)；粘度降低；浮力密度降低等。脱氧核糖核酸的这些变化是爆炸性的，变性发生在非常窄的温度范围内。通常，脱氧核糖核酸双螺旋结构失

4、去一半的温度被称为脱氧核糖核酸的熔点或熔化温度，脱氧核糖核酸的Tm值通常在70和85之间。变性后的脱氧核糖核酸在降温过程中被复性，A260nm纳米值再次降至接近自然状态的消光值。影响脱氧核糖核酸Tm值的因素：脱氧核糖核酸的均匀性越高，熔化温度范围越窄；总碳含量的Tm值随总碳含量的增加而增加。G-C含量可从Tm值计算。经验公式为(g-c)%=(TM-69.3)2.44；一般来说，在离子强度较低的介质中，脱氧核糖核酸的熔化温度较低且较宽。3.操作步骤：1 .将8个恒温水浴箱的温度调节到50、60、70、75、80、85、90、95和1002，取12个带盖的大试管，向每个试管中加入3毫升的脱氧核糖核酸溶液，盖上盖子，每个水浴箱放一个，100个水浴罐放三个。使用10.15毫升/升-0.015毫升/升柠檬酸钠缓冲液(pH7.0)作为对照溶液。3.在100下保存15分钟后，取出另外两个含有DNA溶液的试管，在50和室温下放置0.5小时以上，然后在260纳米波长下测量消光值。1.计算每个温度下的a260纳米(t)/a260纳米(25)，绘制温度比(见图十三)，将每个点连接成平滑曲线，并测量消光值增加的中点，称为Tm。已计算出总碳含量。公式为：(G-C)%=(Tm-69.3)2.44 2