长链非编码RNATSLC1AS1在人脑胶质瘤中的表达及功能研究

1、 分类号：R739.41 密级：公开长链非编码 RNA-TSLC1-AS1在人脑胶质瘤中的表达及功能研究Expressional and Functional Analysis ofLncRNA-TSLC1-AS1 in human glioma作者姓名：学科专业：导师：秦晓勇神经外科学张志文答辩委员会主席:论文答辩日期：二一四年五月二十九日院校地址：邮政编码：北京市复兴路 28号100853 解放军医学院研究生学位论文原创性声明秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新”的学风，本人声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作机取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文

2、中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料，对本文的研究做出贡献的个人或集体，均以在文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关的责任。论文作者签名：指导教师签名：日期：日期：解放军医学院研究生学位论文版权使用授权书本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为解放军医学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复印和电子版本，可以采用影音、缩印、扫描或其他手段保存另外以供本查阅或借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外。论文作者签名：指导教

3、师签名：日期：日期： 解放军医学院博士学位论文目录缩略词一览表.1中文摘要 2英文摘要 5前言 8参考文献.11文 .15正第一部分 TSLC1-AS1在人脑胶质瘤中的表达的研究 . .。 . . 15材料.15方法.17结果.21第二部分上调 TSLC1-AS1的表达对胶质瘤细胞系 U87生物学特性影响的研究.28材料.28方法.29结果.38第三部分应用 siRNA干扰下调 TSLC1-AS1的表达对胶质瘤细胞 SNB19生物学特性影响的研究 .41.材料.41方法.42结果.51论.55讨参考文献.56综 述.59参考文献.63文章发表.66致谢.67 解放军医学院博士学位论文缩略词一览

4、表英文缩写bp英文全称中文全称碱基对base paircDNAcomplementary deoxyribonucleicacid互补 DNADEPCddH20DMSOEDTAFBSdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯双蒸水double distilled waterdimethyl sulfoxjde二甲基亚枫乙二胺四乙酸胎牛血清ethylene diamine tetraacetic acidfetal bovine serumMALAT1metastasisassociatedlung肺腺癌转移相关转录本 1adenoma transcript 1HOTAIRTSLC1H

5、OX transcript antisenseRNAHOX转录反义RNAtumor suppressor in lung cancer 1抑癌基因肺癌抑制物 1TSLC1-AS1tumor suppressor in lung cancer1-antisense 1反义抑癌基因肺癌抑制物 1lncRNAmRNAODlong non-coding RNAmessenger ribonucleic acidoptical density长链非编码 RNA信使 RNA光密度值PBSphosphate buffered salinepolymerase chain reactionReal-time

6、quantitative PCRrotator per minute磷酸盐缓冲液多聚酶链式反应实时定量 PCR转/分钟PCRq-PCRrpmsiRNARISCsmall interference RNARNA-induced silencing complex小干扰 RNARNA诱导沉默复合体1 解放军医学院博士学位论文作者：秦晓勇学科专业：神经外科学导师：张志文长链非编码 RNA-TSLC1-AS1在人脑胶质瘤中的表达及功能研究中文摘要脑胶质瘤约占原发性颅内肿瘤的 40%50%，是中枢神经系统中最常见的肿瘤。传统的治疗手段包括手术治疗，放疗和化疗。但由于胶质瘤呈浸润性生长，肿瘤组织与周围正常

7、脑组织界限不清，手术难以全切，效果不佳，且术后易复发。放疗和化疗常作为术后的辅助手段，不能特异的杀伤肿瘤细胞，同时还可能产生中枢神经系统的毒副作用，因而脑胶质瘤的治疗是神经外科研究的难点之一。探索胶质瘤治疗的新途径，尤其是从基因水平阐明胶质瘤的发生、发展和演变机理，寻找有效的基因治疗的靶点是近年来神经外科研究的的热点。长链非编码 RNA（lncRNA）是一类转录本长度大于 200个核苷酸同时不编码蛋白质的 RNA。研究表明 lncRNA可在表观遗传学，转录及转录后水平调控基因的表达，调控的方式包括染色体修饰，转录激活或干扰等。lncRNA与肿瘤存在密切的关系，一些 lncRNA在正常组织与肿瘤

8、组织中的表达存在显著的差异性，异常的 lncRNA可能在肿瘤的发生中起重要作用，有理由预测 lncRNA可能成为肿瘤诊断和判断预后以及治疗效果的一个新的标志物，同时 lncRNA可以成为一个新的肿瘤基因治疗的靶点。目前关于 lncRNA在中枢神经系统肿瘤中的报道甚少。许多研究表明，蛋白编码基因 TSLC1为肿瘤抑制基因，通常在许多肿瘤中被甲基化下调，包括神经胶质瘤，神经母细胞瘤，肺癌，鼻咽肿瘤，恶性黑色素瘤，食管癌，肝癌，乳腺癌，胃癌，胰腺癌，大肠癌，子宫颈癌和前列腺癌。而 TSLC1的反义转录本 TSLC1-AS1作为 lncRNA家族成员之一，在脑胶质瘤中的表达及对胶质瘤发生、发展的作用尚

9、未见报道。2 解放军医学院博士学位论文本研究采用定量 PCR方法检测了 30例脑胶质瘤组织、正常脑组织及人脑胶质瘤细胞系 U87，U251，SNB19中 lncRNA -TSLC1-AS1和 mRNA -TSLC1的表达情况，研究 TSLC1-AS1在脑胶质瘤组织与正常脑组织中表达的差异性，在不同级别脑胶质瘤中表达的差异性，及其与 TSLC1表达的相关性。结果发现与正常脑组织相比，TSLC1-AS1和 TSLC1在肿瘤组织中的表达水平明显下调（P0.05）。在病理分级较高的脑胶质瘤组织中，TSLC1-AS1和 TSLC1的表达水平明显低于在病理分级较低的脑胶质瘤组织中的表达水平（P0.05）。

10、TSLC1-AS1的表达与 TSLC1的表达呈正相关（R= 0.66，P0.01）。上述结果提示 TSLC1-AS1在人脑胶质瘤细胞中的表达水平显著降低，其表达水平随脑胶质瘤恶性程度的增高而降低，可作为脑胶质瘤诊断，临床分级及判断预后的分子指标。在此基础上构建了 TSLC1-AS1表达载体 pcDNA- TSLC1-AS1，利用其转染U87细胞株，获得高表达 TSLC1-AS1的 U87细胞；应用 MTS分析法检测TSLC1-AS1表达升高对 U87细胞增殖的影响。应用 Transwell实验检测 TSLC1-AS1表达升高对U87细胞迁移能力的影响。结果发现转染了 pcDNA- TSLC1-

11、AS1的 U87细胞系中 TSLC1-AS1的表达上调，明显高于 pcDNA control对照组（P0.05），同时 TSLC1的表达也明显上调，高于 pcDNA control对照组（P0.05）。转染pcDNA- TSLC1-AS1后 24，48，72，96小时，U87细胞增殖率显著低于对照组（P0.05）。迁移度与对照组相比显著减少（P0.05）。此后，我们利用TSLC1-AS1 siRNA质粒转染 SNB19细胞株，获得低表达 TSLC1-AS1的 SNB19，进一步验证了 TSLC1-AS1表达变化对胶质瘤细胞增殖与迁移能力的影响。结果发现转染了双链 TSLC1-AS1-siRNA

12、1及 TSLC1-AS1-siRNA2的 SNB-19细胞系中TSLC1-AS1的表达明显下调，在 TSLC1-AS1-siRNA1干扰组中，TSLC1-AS1的表达下调约 90%，明显低于对照组（P0.05），同时 TSLC1的表达也明显下调，低于对照组（P0.05）。在转染了 TSLC1-AS1-siRNA1正义链的 SNB-19细胞系中TSLC1-AS1和 TSLC1的表达明显下调，低于对照组（P0.05）。而在转染了TSLC1-AS1-siRNA1反义链的 SNB-19细胞系中，TSLC1的表达却未见明显下调（P0.05）。该结果排除了 TSLC1-AS1-siRNA1反义链对 TSL

13、C1的表达下调的脱靶效应，进一步确认了在 SNB-19细胞系中下调 TSLC1-AS1的表达可下调 TSLC1的表达。用 MTS法检测转染 TSLC1-AS1-siRNA1及 TSLC1-AS1-siRNA2后人脑胶3 解放军医学院博士学位论文质瘤细胞株 SNB19的增殖能力，转染 TSLC1-AS1后 24，48，72，96小时，SNB19细胞增殖率显著高于对照组（P0.05）。此外 Transwell实验进一步证实 TSLC1-AS1表达降低可以显著提高 SNB19细胞的迁移能力（P0.05）。上述结果表明上调TSLC1-AS1在胶质瘤中的表达可同时上调 TSLC1的表达，抑制肿瘤的增殖、

14、迁移能力，反之亦然。该研究为脑胶质瘤的靶向治疗提供了理论依据。关键词：胶质瘤；长链非编码 RNA；TSLC1；TSLC1-AS1；实时定量 PCR；cDNA；siRNA；靶基因4 解放军医学院博士学位论文Expressional and Functional Analysis of LncRNA-TSLC1-AS1in human gliomaAbstract Glioma is the most common tumor of the central nervous system, accounting for40% 50% of primary intracranial tumors. T

15、raditional therapy include operation,radiotherapy and chemotherapy. But because of its infiltrating growth, the boundaries oftumor tissue and surrounding normal brain tissue are not clear, total resection is difficult,and the general effect is not satisfactory, also it is easy to recurrence after su

16、rgery.Radiotherapy and chemotherapy are often used as auxiliary means after the operation.But they can not high specificly kill tumor cells, also may produce side effects of centralnervous system .So the treatment of glioma is always one of the difficult problems inthe Department of neurosurgery. Ex

17、ploreing a new treatment of glioma, especially themechanism of its occurrence, development and evolution on gene level, finding aneffective target of gene therapy is the hotspot and difficulty in research of Department ofneurosurgery in recent years.Long non coding RNA (lncRNA) is a kind of non prot

18、ein coding RNA and itslength is greater than 200 nucleotides. Research shows that lncRNA can regulate geneexpression on the level of epigenetics, transcription and post transcription bychromosome modification, transcriptional activation or interference. There is a closerelationship between lncRNA an

19、d tumors. The expression of lncRNA in some tumortissues and their normal tissues are significantly difference. Abnormal lncRNA may playan important role in tumorigenesis. So we predict that lncRNAs could act as a newmarker of diagnosis and judgment of prognosis and therapeutic effect of tumor,meanwh

20、ile as a new therapeutic target in cancer gene therapy.At present, research about lncRNA in central nervous system tumors is little.Protein coding gene TSLC1 has been identified as the tumor suppressor gene which isoften down-regulated by hypermethylation in many tumors, including glioma, lungcancer

21、, neuroblastoma, nasopharyngeal cancer, malignant melanoma, esophageal cancer,liver cancer, breast cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, cervical5 解放军医学院博士学位论文cancer and prostate cancer. While TSLC1-AS1, the antisense transcript of TSLC1, as amember of the lncRNA families, it

22、s expression in glioma and its function in occurrence,development of glioma have not been reported.In this study, real-time quantitative PCR were used to detect the expression oflncRNA TSLC1-AS1 and mRNA TSLC1 in 30 cases of glioma tissues and 30 cases ofnormal brain tissues, and in glioma cell line

23、s U87, U251 and SNB19. The differenceexpression of TSLC1-AS1 in glioma tissues and normal brain tissues, differentexpression in different grades of glioma, and correlation of its expression with TSLC1were studied. The results showed TSLC1-AS1 and TSLC1 expression levels in gliomawere significantly d

24、own-regulated compared with normal brain tissues（P0.05）. Theexpression levels of TSLC1-AS1 and TSLC1 were significantly lower in tumors ofhigher pathological stage than that in tumors of lower pathological stage（P0.05）. TheTSLC1-AS1 expression was positively correlated with TSLC1 expression（R= 0.66，

25、P0.05）. The resultsshowed that the SNB19 cells in TSLC1-AS1 siRNA transfected groups grewsignificantly faster compared with the cells in the negative control group（P0.05）. TheTranswell assay also showed significant cell migration elevation in the TSLC1-AS1siRNA group compared with the negative contr

26、ol group（P0.05）. These resultssuggest that overexpression of TSLC1-AS1 can up-regulate expression of TSLC1 andinhibit the proliferation, migration of glioma, and vice versa. The study provides atheoretical basis to target treatment of brain glioma.Keywords: glioma; long non coding RNA; TSLC1; TSLC1-

27、AS1; real-time quantitativePCR; cDNA; siRNA; target gene7 解放军医学院博士学位论文前言脑胶质瘤约占原发性颅内肿瘤的 40%50%，是中枢神经系统中最常见的肿瘤，且随年龄的增加其发病率有逐年增高的趋势1,2。按世界卫生组织（WHO）关于脑肿瘤的病理分类，脑胶质瘤依其恶性程度分为四级：III级即所谓低级别胶质瘤，恶性程度较低；III级为间变性胶质瘤；IV级为胶质母细胞瘤。IIIIV胶质瘤均为高度恶性胶质瘤，根据世界卫生组织的统计，其发病率为 5-8/100, 000，是35至 55岁肿瘤患者居第 4位死亡原因，是 34岁以下肿瘤患者居第二位

28、的死亡原因。胶质瘤传统的治疗手段包括手术治疗，放疗和化疗。由于胶质瘤呈浸润性的生长特性，肿瘤组织与周围正常脑组织常无明显的界限3。并且恶性脑胶质瘤在早期就表现出非常强的浸润特性，所以手术治疗手段很难做到全切，易复发4。化疗和放疗常作为术后的辅助治疗手段，不能高度特异地杀伤胶质瘤细胞，同时还可能产生中枢神经系统的毒副作用。所以，据统计，III级间变性胶质瘤的 5年生存期为 1.5年，而 IV级胶质母细胞瘤的五年生存期仅为 9-12个月5-7。总之，到目前的为止，胶质瘤的治疗方式及治疗效果没有出现根本性的变化，恶性胶质瘤一直是神经外科难以应付的疾病，阐明胶质瘤的发病机理、寻找新的有效的治疗方法仍然

29、是神经外科领域的热点与难点。随着现代医学技术的不断发展，出现了许多新的治疗胶质瘤的手段，如基因治疗，免疫治疗，抗血管治疗等等。尤其是基因治疗，更是其中的热点。肿瘤的发生发展是一个多基因、多因素及多阶段共同参与的极其复杂的生物学过程8，许多学者致力于寻找与胶质瘤相关的基因，虽已找到了相当多的相关基因，但仍然不能完全阐释胶质瘤的发生发展。基于叠瓦式芯片和新测序技术的运用，人类基因组计划得以完成，让人惊讶的是，在整个人类基因组序列中，编码蛋白质的基因仅占不到 2%，其他序列虽不编码蛋白质但超过 90%同样能被转录成 RNA，这些RNA称为非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA）9。

30、非编码 RNA正在许多领域引起研究人员的关注，相关文献报道呈指数增长 10。目前的研究多集中在短链的非编码 RNA，如微小 RNA（microRNA，miRNA）和小干扰 RNA,但这只是 ncRNA一部分，还存在许多其他类型的 ncRNA。一些研究者通过传统的手段克隆了一些RNA转录本，发现这些 RNA的特征是不编码任何蛋白质，同时又比诸如 miRNA8 解放军医学院博士学位论文的基因序列更长，这些 RNA被称为长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）11。通常认为 lncRNA是一类转录本长度大于 200个核苷酸同时不编码蛋白质的 RNA11。最初认为，l

31、ncRNA没有生物学功能，进一步的研究证明，lncRNA可调控基因的表达，涉及的调控层面包括表观遗传学、转录及转录后，调控的方式包括染色体修饰、转录激活或干扰等12。lncRNA与肿瘤存在密切的关系，研究提示一些 lncRNA在正常组织与相应的肿瘤组织中的表达存在显著的差异性，异常表达的 lncRNA可能在肿瘤的发生中起重要作用，同时，特异性表达的 lncRNA可作为肿瘤的预测因子13。目前，一些 lncRNA与肿瘤的关系已很清楚，例如（1）HOTAIR与乳腺癌、肝癌、结肠癌密切相关14-16。HOTAIR在乳腺癌原发性和继发性转移灶组织中显著高表达，定量 PCR检测显示，HTOAIR在乳腺癌

32、转移灶组织中的表达水平是正常组织的 200倍，其在原发灶中的表达水平是预测乳腺癌转移和不良预后的重要指标14。同样的，HOTAIR在 64%的原发性肝癌组织高表达，并且，原发灶中的表达水平与肝癌的转移、复发及预后密切相关 15。HOTAIR在结肠癌组织中的表达也显著高于正常结肠组织，表达水平越高，提示患者预后越差16。（2）MALAT1与非小细胞肺癌的高转移性与不良预后相关17。Xu等18通过逆转录聚合酶链反应方法对 9例肝癌细胞株和 112例肝癌病例进行 MALAT1基因表达分析，均有表达上调，且 MALAT1表达越高的病例肝移植术后越容易复发，可以作为肝癌复发的预测因子。MALAT1的表达

33、水平与肿瘤的转移相关，一些研究提示，通过 RNA干扰介导的 MALAT1沉默，可以减少肺癌细胞的迁移和宫颈癌细胞的侵袭潜力19-20。（3）H19是一个双功基因，兼具致癌和抑癌的双重功能。例如，H19在肝癌及前列腺癌中呈高表达，说明其具有癌基因的作用21。而另一些研究却显示，H19基因的缺失可促进结肠癌、畸胎瘤等肿瘤的生成及增大，起抑癌基因的作用22。总之，lncRNA作为一个新的研究领域正在引来越来越多研究者的关注。目前作为非编码 RNA成员之一的 miRNA在肿瘤的临床和基础研究中已取得了重要的研究成果，有理由预测 lncRNA在肿瘤的诊断和治疗中同样具有潜在的重要价值。首先，lncRNA

34、可能或已经成为肿瘤诊断和判断预后以及治疗效果的一个新的标志物。lncRNA在正常组织和肿瘤组织中的表达存在显著差异性。例如 HOTAIR在恶性肺部肿瘤中的表达是正常肺组织的成百上千倍14。LncRNA新型前列腺癌抗原 3在前列腺癌中的表达是正常组织的 60倍23，已被作为前列腺癌9 解放军医学院博士学位论文的特异性分子标志物，其特异性高于血清前列腺癌特异性抗原24。其次，lncRNA可以成为一个新的肿瘤基因治疗的靶点。短链的 miRNA具有作为基因治疗靶点固有的优越性25，然而 lncRNA比 miRNA更长，不能成为直接治疗的靶点，但是可以利用病毒、人工合成的小干扰 RNA或设计特殊的药物作

35、为治疗载体。之前，关于 lncRNA在中枢神经系统肿瘤中的报道一直较少。Zhang等研究了lncRNA成员之一 MEG3与脑膜瘤的关系，正常人脑膜细胞可见 MEG3高表达，而脑膜瘤细胞却不见其表达，且脑膜瘤分级与 MEG3表达缺失的程度相关26。而近期， lncRNA在脑胶质瘤的研究报道逐渐增多。一方面，一些胶质瘤相关的高通量 lncRNA芯片数据相继被报道，这些可能与胶质瘤发病相关的新的功能 lncRNA可能对未来胶质瘤 lncRNA研究提供极具价值的信息27-30 另一方面，既往已知的一些肿瘤相关 lncRNA，如 HOTAIR，H19，MEG3等，它们在其他肿瘤中的重要作用早已被人们认识

36、，而近来的研究表明，它们在胶质瘤的发展和演进过程中，起着同样重要的作用。从 lncRNA在其他肿瘤中的发展趋势来看，与胶质瘤相关的 lncRNA在不远的将来，很可能成为新的研究热点和极具潜力的突破点 31-33。由此，也引起了我们对 lncRNA在胶质瘤中研究的兴趣。LncRNA对基因的表达调控具有很多种不同的方式，而针对临近基因的顺式作用，是一种最为常见的调控方式。尤其是处于 mRNA反义链的 lncRNA转录本，常常与其正义的 mRNA有着密切的联系。本课题的研究对象 ENST00000546273/RP11-713B9.1是一个功能尚未报道的lncRNA成员，它位于 11q23.2，全长

37、 301bp，它是蛋白编码基因 TSLC1的反义转录本，我们将之命名为 TSLC1-AS1。蛋白编码基因 TSLC1（也被称为 CADM1，IGSF4，SynCAM，sgigsf和 Necl-2）是我们一直关注的重要肿瘤相关基因。目前已经被许多研究证实为肿瘤抑制基因，TSLC1的表达通常在许多肿瘤中被甲基化下调，从而导致肿瘤发生，肿瘤侵袭性变强，这些肿瘤包括神经胶质瘤，神经母细胞瘤，肺癌，鼻咽肿瘤，恶性黑色素瘤，食管癌，肝癌，乳腺癌，胃癌，胰腺癌，大肠癌，子宫颈癌和前列腺癌 34-45 。TSLC1在肿瘤中的作用如此重要，但目前关于 TSLC1调控途径除了甲基化调10 解放军医学院博士学位论文

38、控外，其余调控方式仍未研究清楚，尤其在胶质瘤中，这方面研究少见报道。我们推测，作为 TSLC1反义链的 lncRNA-TSLC1-AS1，很可能参与 TSLC1的调控，并在胶质瘤的发生发展中扮演重要的角色。综上，本课题目的是确定 lncRNA-TSLC1-AS1在脑胶质瘤中的表达情况，探讨其功能对胶质瘤细胞生长特性的影响，并分析它与 TSLC1的相互作用。以期为未来胶质瘤的诊断治疗提供新的诊断标志和治疗靶点。参考文献1 MischelPS,CloughesyTF.Targeted molecular therapy of GBM. BrainPathol.2003,13(1):52-61.2

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