第17色谱分析概论.ppt

1、第十七章 色谱分析法概论 chromatography,色谱法是最重要的分离技术，篇幅约占书的三分之一,色谱法概述 色谱过程和术语 色谱法基本理论 基本类型色谱的分离机制,第一节 色谱法概述,一、色谱法（chromatograph）的起源和发展 11906年由俄国植物学家Tsweet创立 植物色素分离见图示 2、1931年胡萝卜素异构体的分离 3、3040年代TLC、PC平板色谱法的出现 4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、 吸附色谱和电泳领域取得了成果 5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱 6、60年代GC-MS联用 7、70年代HPLC崛起,图示,固定相

2、CaCO3颗粒 流动相石油醚,植物色素混合物,2现在：一种重要的分离、分析技术 分离混合物各组分并加以分析 固定相除了固体，还可以是液体 流动相液体或气体 色谱柱各种材质和尺寸 被分离组分不再仅局限于有色物质,色谱学的重要作用,应用的科学领域：生命科学、材料科学、环境科学等 药学： 1、教材内容多，约占全书的三分之一。 2、药学各个专业都会用到色谱分析法 药典 2005年版 2000年版 部 药品 1967种 1699种 HPLC分析 848种 567种 3、考研 大综合包括分析、有机、生理、生化 其中分析75分约近一半是色谱内容,二、色谱法定义、分离基础和目的,定义：利用各组分物理化学性质的

3、不同，在流动相流 经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分 配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移 动，最终达到分离的目的。图例 分离基础：差速迁移 (例:赛跑) 目的：多组分分离，实现定性定量分析,图示,分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开,碳酸钙 吸附剂,石油醚 流动相,色素,气相色谱：流动相为气体（称为载气） GC 按固定相不同分为：气固色谱 (GSC) 气液色谱 (GLC),三、色谱法分类： 1按两相分子的聚集状态分：,液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液） LC 按固定相的不同分为：液固

4、色谱 (LSC) 液液色谱 (LLC)。,2按固定相的固定方式分：,续前,3按分离机制分：,分配色谱：利用分配系数的不同（固定相液体） （ partition chromatography） 吸附色谱：利用物理吸附性能的差异（固定相固体） （ absorption chromatography） 离子交换色谱：利用离子交换原理（固定相离子交换树脂） （ion exchange chromatography ） 空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同（固定相凝胶） （size exclusion chromatography）,色谱法简单分类,四、色谱法的特点,优点：“三高”、“一快”、“一广”,缺

5、点：,第二节 色谱过程与术语,一、色谱过程 二、基本术语,1、流出曲线和色谱峰 2、基线、噪音和漂移 3、峰宽柱效参数 4、峰高和峰面积定量参数 5、保留值定性参数 6、分配系数和容量因子相平衡参数 7、等温线 8、分离因子和分离度分离参数,一、色谱过程,色谱过程：指物质分子（被分离组分）在相对运动的 两相（流动相和固定相）中的“分配”平衡过程,以吸附色谱为例见图示 色谱过程： 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离,图示,吸附能力弱的组分先流出 吸附能力强的组分后流出,组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。

6、,二、基本术语,1流出曲线和色谱峰,流出曲线（色谱图 chromagtogram）：电信号强 度随时间变化曲线 色谱峰(peak)：流出曲线上突起部分,2基线、噪音和漂移 base line, noise and drift,基线：仅有流动相通过检测器时产生 的信号曲线。反映检测器噪音 随时间变化的曲线 （稳定平直直线） 噪音：仪器本身所固有的，以噪音 带表示（仪器越好，噪音越小） 漂移：基线向某个方向稳定移动 （仪器未稳定造成）,3峰宽 peak width：色谱柱效参数,峰宽W：色谱峰两侧拐点切线与基线相交的截距,标准差： 为正态分布曲线两拐点间距离的一半。 对应0.607h处峰宽的一半

7、注：小，峰窄，柱效高 半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽,注：除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积,图示,峰高(peak height；h)：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。 峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间包围的面积。,4峰高和峰面积：色谱定量参数,5保留值：色谱定性参数,保留时间 retention time, tR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间 死时间dead time, t0：不被固定相滞留组分的保留时间，相当于流动相到达检测器所需要的时间,调整保留时间tR：组分由于和固定相作用，比不作用的组分在

8、柱种多停留的时间，即组分在固定相中滞留的时间。等于组分的保留时间与死时间之差值,表示组分在色谱固定相内滞留状态的参数,（1）时间表示的保留值,图示,续前,保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需要的 流动相的体积。 VR与tR和Fc（流动相流速mL/min）的关系,死体积V0：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间 体积。包括从进样器到色谱柱导管的体积、固定相的孔隙及颗 粒间隙、 柱出口导管及检测器内腔体积的总和。,（2）用体积表示的保留值,续前,调整保留体积VR：保留体积与死体积之差，即组分 停留在固定相时所消耗流动相的体积,V0 和 Vm、t0 和 tm 的区别,V0 ：由

9、进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空 间体积 ； 流定相充满死体积所需的时间为t0 。 Vm ：平衡时流动相在色谱柱中占有的体积，流动相经 过色谱柱所需时间用tm 表示。 Vm V0，tm t0 的物理意义有区别。 在多数情况下，可忽略导管和检测器内腔的容积， Vm 和 V0视为近似相等。,图例,下一张,返回,6分配系数和容量因子：相平衡参数,分配系数K（partition coefficient , 平衡常数）：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比,注：K为热力学常数 与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关 实验条件固定，K仅与组分性质有关

10、不同分离机理的色谱中，K名称虽有所不同，但物理意义都 一样，表示平衡状态下两相中浓度之比,tR与K的关系：,续前,讨论： 色谱条件一定时，tR主要取决K的大小 （色谱法基本的定性参数 ）,分配系数K不容易获得，不常用,续前,容量因子（capacity factor, 容量比，分配比）k： 在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量比,结论：色谱分离前提各组分分配系数不等,注：应选择合适分离条件使得难分离的组分K不等,2）色谱条件（s，m，T）一定时，K一定 tR一定,7、等温线：(P442),定义：指一定温度下，组分在两相中分配达平衡时，在两相 中的浓度关系曲线，即cs对cm的关系曲线 图示,

11、(1) 线性等温线（理想）对称峰 (2)非线性等温线 凸形拖尾峰（常见） 凹形前沿峰,固定相表面活性吸附中心未达饱和，K一定，与溶质浓度无关,固定相表面吸附中心活性不均，溶质分子先占据强吸附中心再 占据弱吸附中心，K随着溶质浓度的增加而减小,溶质与固定相作用，改变其表面性质，K随着溶质浓度的增加 而增加,斜率=K,线性：对称峰,凹形：前沿峰,凸形：拖尾峰,对称因子：（拖尾因子）,fs在0.951.05之间,fs小于0.95,fs大于1.05,对称因子(symmetry factor) 衡量色谱峰对称性,8.分离因子和分离度：分离参数 描述相邻组分分离状态的指标,（1）分离因子（分配系数比或选择

12、性系数） 定义：两种物质调整保留值之比,分离因子1是色谱分离的必需条件,（2）分离度（resolution, R）： 衡量色谱分离条件优劣的参数 定义：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍,讨论,设色谱峰为正常峰，W1W2= 4,第二节 色谱过程与术语,一、色谱过程 二、基本术语,1、流出曲线和色谱峰 2、基线、噪音和漂移 3、峰宽柱效参数 4、峰高和峰面积定量参数 5、保留值定性参数 6、分配系数和容量因子相平衡参数 7、等温线 8、分离因子和分离度分离参数,第三节 色谱法基本理论,要使R大，必须： 1、tR大- k大-热力学 2、W小-峰展宽小-动力学,分离度：,色谱理论包括两方面:

13、 热力学理论：研究分配(分离)过程，塔板理论（plate theory）。 动力学理论：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（rate theory）。,一、塔板理论 plate theory,始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。 分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。,色谱柱每个H高度内有一块塔板，共有若干块塔板。组分在每块塔板两相间分配达平衡，K小的先出柱。多次分配平衡，K有微小差异组分仍可获较好分离,假想：,（一）塔板理论的四个基本假设,1柱的组成为多个连续、等距塔板，每塔板内组分分配瞬间达 平衡（H理论塔板高度） 2流动相间歇式进入色谱柱，每次进

14、一个塔板体积 3样品和载气均加在第1号塔板上，沿柱方向纵向扩散忽略 4分配系数在各塔板上是常数,结果：当塔板数很大时，组分色谱流出曲线为趋 于正态分布,（二）理论板数和理论塔板高度的计算,L ：柱长,色谱柱效参数,续前,有效理论板数和有效理论塔板高度的计算,塔板理论的贡献：从热力学角度,解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置 提出了评价柱效高低的n和H的计算式,须在给定条件，指定组分测定时才有意义 缺点：,1.柱效不能表示被分离组分的实际分离效果。 2.塔板理论无法解释同一色谱柱在不同流动相流速下柱效不同的 结果，无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,练习,例： GC法，柱长为2m，固

15、定相5%的OV-17、柱温为1250C，记录纸速度为2.0cm/min的色谱条件下，测定萘的保留时间为2.35min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数和板高。若用甲烷测得死时间为0.20min，求有效理论塔板数和板高。（见书上P444例）,解：,二、速率理论 rate theory,塔板理论成功处： 解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR 评价柱效（n，）,塔板理论存在问题: 1）做出了四个与实际不相符的假设 忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程 2）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释板高的 影响因素 3）排除了一个重要参数流动相的线速度u， 因而无法解释柱效与流速关系 更无法

16、提出降低板高的途径,速率理论影响柱效因素,1956年，荷兰学者范第姆特(Van Deemter)提出了色谱过程动力学理论速率理论。,塔板高度,涡流扩散项,纵向扩散项,传质阻抗项,H = A + B/u + Cu,吸收了塔板理论的有效成果H， 并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素,u载气线速度，cm/s,流速与柱效的关系,H = A + B/u + Cu,1. 涡流扩散项（多径扩散项）：A,产生原因：载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒 的阻力路径不同涡流扩散 next,注：颗粒太小，柱压过高且不易填充均匀 空心毛细管柱（0.10.5mm），A=0，n理较高,：填充不规则因子，填充技术和填料颗

17、粒形状决定。 dp：填料 (固定相) 颗粒的平均直径， dp小，A小；但dp太小，和柱阻大。,图示,back,柱填充不均匀,2. 纵向扩散项（分子扩散项）：B/u,产生原因： 峰在固定相中被流动相推动向前、展开 两边浓度差,续前,注：为降低纵向扩散，宜控制较高线速度，选用分子 量较大的载气和较低的柱温,选择载气原则：兼顾分析时间和减小纵向扩散 u 较小时，选M较大的N2气（粘度大） u 较大时，选M较小的H2气，He气（粘度小）,B的影响因素：,B/u的影响：,3. 传质阻抗项：Cu,产生原因：样品在气液两相分配，样品未及溶解就 被带走，从而造成峰扩张,影响因素：,传质：溶解、扩散、转移的过程

18、。 传质阻抗：影响传质过程的阻力。,续前,讨论：,注：固定液应完全覆盖载体表面，不可以太薄， 否则柱子寿命短，k太小； T不可以超过固定液最佳使用温度,小结：范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中，填充 均匀程度、填充物的粒度、流动相的种类及流速、 固定相的液膜厚度等对柱效和峰展宽的影响,三 影响分离度的因素,1分离度定义式 2分离度计算式,前提定义式基础上，相邻两组分的n一致（假设）,柱效项,柱选择项,柱容量项,a柱效项及其影响因素：,影响色谱峰的宽窄 主要取决于色谱柱性能及载气流速,注：柱长过长，柱阻增大,练习,例：两组分在1 m长柱子上的分离度为0.75，问使用 多长柱子可以使它们完全分离

19、？,解：,续前,讨论：,增加柱效是提高分离度的一个直接有效手段 提高柱效、改善分离的途径：增加柱长；降低板高 根据速率理论，降低板高、提高柱效的方法是： 1）采用粒度较小、均匀填充的固定相（A项 ） 2）分配色谱应控制固定液液膜厚度（C项 ） 3）适宜的操作条件： 流动相的性质和流速，柱温等等（B项 ） 选用分子量较大、线速度较小的载气N2气， 控制较低的柱温,b柱选择项及其影响因素：,影响峰的间距 主要受固定相性质，以及柱温影响,c柱容量项及其影响因素：,影响峰位 主要受固定相用量、柱温和载气流速的影响,图示,k 影响峰位,n 影响峰宽窄,影响两峰间距,练习,如何根据具体情况改进分离度？,太

20、小，两组分未分开 应改变固定相极性，降低柱温,k 太小，n 也太小， 应增大固定液用量，降低柱温,n 太小，许多组分未分开 应设法降低板高，提高柱效,第四节 基本类型色谱法的分离机制,（一）吸附色谱法 （二）分配色谱法 （三）离子交换色谱法 （四）空间排阻色谱法,对于不同的分离机理，K的含义不同。 吸附色谱 吸附系数 分配色谱 分配系数 离子交换色谱 离子交换系数 统称K 分子排阻色谱 分子排阻系数,（一）吸附色谱法,要求： 固定相吸附剂（硅胶或AL2O3） 具表面活性吸附中心 分离机制：见图示,吸附系数,注：Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质 及温度有关 next,吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,图示,分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开 back,（二）分配色谱法,要求： 固定相机械吸附在惰性载体上的液体 流动相必须与固定相不为互