生物化学核酸生物合成

1、Biosynthesis of nucleic acid,第十二章核酸的生物合成,分子生物学(分子遗传学)中心法则,反映了从DNARNA蛋白质的遗传信息主流，揭示了生物体内遗传信息的贮存、传递和表达的规律。,ATGC,第一节 DNA的生物合成 Biosynthesis of DNA,DNADNA DNA复制,RNADNA 反转录,两种方式,一、DNA的复制,基本概念 以参与反应的要素进行定义,必须具备的基本条件,模板：母链DNA,原料：dNTP (包括dATP、dGTP、 dCTP、dTTP),酶和蛋白质因子：,引物：一小段RNA,能量（ATP）及某些无机离子,DNA的复制的方式-,1958,

2、 Messelson and Stahl实验证实,DNA半保留复制,Watson 和Crick 提出的 DNA 双螺旋复制模型,含15N-DNA的细菌,第一代,普通DNA,细菌的DNA双链,(黄线的代表含15N),DNA半保留复制的证据,可排除全保留式,Why?,排除全保留式,培养第一代结果,参与DNA复制的酶类与 蛋白质因子及其主要作用,1. 拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）,无ATP时：作用相当于Topo,但切割的是双链DNA某一部位(断双链)。,有ATP时：使带断口、松弛状的DNA分子旋紧转变成负超螺旋结构，再连接断端。,不需耗能(ATP)，切割(断)双链DNA中的一链

3、，松解螺旋, 封闭切口。又称切割封口酶。,Topo的作用,Topo(又称旋转酶)的作用,2. 解链酶(又称解螺旋酶或螺旋酶,helicase),作用：断裂互补碱基间的氢键,使DNA双链分离形成“复制叉”。具有这种功能的是一类酶如复制蛋白(rep蛋白)、解链酶II等。,3.单链DNA结合蛋白(DNA结合蛋白),(single stranded DNA-binding protein, SSB),作用：防止重新形成双 链和防止单链模板被核酸酶水解,维持DNA单链状态和完整性.,4.引物酶(Primase),RNA的合成：需引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。,DNA不能从无有合成，需在一小段RNA

4、基础上合成DNA,原核生物（E.coli）迄今已知只有3种：DNA pol、 DNA pol、 DNA pol。,真核生物 亦发现有多种DDDP： DDDP 、 。,其性质与功能 见表12-1 P293 和表12-2 P297,5. DNA聚合酶（DNA polymerase, DNA pol）,即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）,3 模板链 5 ,DDDP 53聚合作用示意图,5,3,6. DNA连接酶(DNA Ligase),作用：在有模板指导的条件下，催化2个 DNA片段(两片段间的距离为1个3, 5-磷酸二酯键的键长)的连接。,原理：在一个DNA片段的3-OH末端和另 一个DNA

5、片段的5-P末端形成3, 5-磷酸二酯键，从而实现连接。,特点：原核细胞:需辅助因子NAD+,真核细胞:不需辅助因子NAD+,但需 耗能(ATP),参与DNA复制的酶及蛋白质,酶或蛋白质 主要作用,拓扑异构酶类 克服解链时打结及缠绕、松驰或引,进负超螺旋,解链酶类 解开DNA双链,单链DNA结合蛋白 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,DNA聚合酶 DNA复制,DNA聚合酶 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,DNA的复制过程,复制的起始,链的延长,复制的终止,复制的起始,1.在拓扑异构酶、解链酶及单链DNA 结合蛋白的共同作用下，DNA

6、解旋、 解链，形成复制叉。,2.依赖于单链模板，由引物酶催化按 碱基配对规律合成一小段RNA引物(原核细胞引物长50-100个碱基，真核约10个碱基)。,复制起始阶段的特点,真核细胞：具有多个 起始位点,原核细胞：仅有一个复制起始位点，但往往是双向复制,链的延长,引物合成后，由DNA pol（真核细胞为DNA聚合酶或)催化，在引物3-OH末端逐一添加与模板链对应互补的脱氧核苷磷酸,使新合成的链不断延长。,领头链: 链的延长方向(53)与解链方向(复制叉移动方向)相同, 为连续合成。,随从链: 链的延长方向(53)与解链方向(复制叉移动方向)相反，为不连续合成。,分段合成的DNA片段, 最初被命

7、名为冈崎片段,复制的终止,1.水解引物及填补空隙,冈崎片段合成后，由DNA pol(真核细胞可能是DNA聚合酶)水解去除RNA引物，并填补留下的空隙(5 3)聚合。,2.完整双链DNA分子的形成,填补空隙后，DNA片段与片段之间还有一个缺口(一个3,5-磷酸二酯键的长度), 由DNA连接酶催化连接成完整的链，从而产生完整的双链DNA分子。,二、反转录(reverse transcription),概念,以RNA为模板，dNTP为原料，反转录酶催化，按碱基配对规律合成DNA的过程。,反转录酶, 又称为依赖RNA的DNA聚合酶,(RNA-dependent DNA polymerase, RDDP

8、),DNA,RNA,RNA(病毒),病毒RNA,RNA-DNA,杂化分子,cDNA,前病毒,(双链DNA),酶催化反应示意图,反向转录酶存在于所有致癌RNA病毒中, 其功能可能与病毒的恶性转化作用有关;,但它也存在于某些正常细胞中，在细胞分化与胚胎发生中可能起某些作用。,反转录病毒和反转录酶的发现, 提出了一个重要的医学问题病毒致癌及癌基因。,反转录的医学意义,反转录的医学意义,癌基因(oncogene):能在体外引起细胞恶性转化,在体内诱发肿瘤的基因.,细胞癌基因(c-onc)或原癌基因(pro-onc): 存在于生物正常细胞基因组中的癌基因. 正常情况下基因处于静止或低表达的状态. 当受到

9、致癌刺激被活化并发生异常时则可发生细胞癌变.,病毒癌基因(v-onc): 存在于致瘤病毒中的能使靶细胞发生恶性转化的基因.,用三个小写字母表示癌基因名称,如myc, fos, ras, src等,抑癌基因: 是一类抑制细胞过度生长,增殖从而遏制肿瘤形成的基因.如Rb,P53,P16等,癌基因与抑癌基因之间一般处于动态平衡状态,是一种反转录病毒, 可引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS,艾滋病).,反转录酶在基因工程,分子病的基因治疗方面也有重要作用.,人类免疫缺陷病毒(HIV),反转录的医学意义,DNA的损伤与修复,一、DNA损伤 (DNA damage),生物体受某些理化和生物等外源性因素或机

10、体内环境改变的影响，引起DNA分子结构的任何异常改变称为DNA损伤,概念,UV,引起DNA损伤的因素,紫外线(常产生嘧啶二聚体),电离辐射(断磷酸二酯键),物理因素,胸腺嘧啶二聚体的产生,化学因素：均能干扰复制与转录功能,烷化剂：(如氮芥类, CTX)，使鸟嘌呤的 N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点,亚硝酸盐：使碱基脱氨,原G-C配对最终变为A-T配对，导致错配,CU,AI,GX,丝裂霉素：与DNA共价连接引起链交联,I （次黄嘌呤）,糖苷键自行断裂；自发脱氨基作用, CU，AI。,生物因素：目前多指病毒,生理因素：机率极低,突变(mutation) ：有机体基因组可遗传的改变，即DNA序列

11、的改变.,根据引发的原因，可将突变分为： 诱发突变和自发突变。,缺失,根据 DNA分子的改变，突变可分为4类：,点突变,缺失或插入的碱基数不是3的整 倍数时，则引起移码突变,插入,倒位(或易位),转换：同型碱基间变异,Pu Pu Py Py,转换：同型碱基间变异,Pu Pu Py Py,转换：同型碱基间变异,Pu Pu Py Py,转换：同型碱基间变异,Pu Pu Py Py,基因突变可能出现的后果,生物体致死,生物体某些功能丧失,仅改变基因型，表现型不受影响,改变生物物种，出现新的生物特征,DNA复制过程所发生的突变(碱基配对错误)，由核内DNA聚合酶以其校读功能予以纠正.,若碱基错配频频发

12、生或损伤范围大，则需采用以下修复方式进行修复.,二、DNA损伤的修复,T+T,DNA修复方式,1.光修复:,2.切除修复：由3种酶共同参与完成。,DNA pol I,DNA连接酶,过程,3.重组修复：亦称复制后修复,4. SOS修复：DNA分子受到较大范围的损伤，细胞对危急状态所作出的反应。,机制,引起DNA较长期的、广泛的突变。,SOS调节网诱导产生的DNA聚合酶特异性低，识别碱基能力差, 使修复部位仍存在较多错配的碱基，但细胞能继续生存。,后果,第二节 RNA的生物合成 （Biosynthesis of RNA）,转录（transcription） 生物体以DNA的一条链为模板，以NTP为

13、原料合成RNA的过程,转录,复制和转录的区别,转录的模板和酶,转录以在DNA的一条链为模板，另一条链为编码链（不转录），这样模板链不总在同一条链上，这种转录方式称为不对称转录 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链，也称为反义链或Crick链,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,5 3,3 5,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,结构基

14、因,RNA聚合酶,（一）原核生物的RNA聚合酶,核心酶,全酶,转录起始,转录延长阶段亚基脱落,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,（二）真核生物的RNA聚合酶,模板与酶的辨认结合,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子，包括若干个结构基因及其上游的调控序列,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子,开始转录,T T G A C A A A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点,转录过程,一、原核生物的转录过程 （一）转录起始,1. RNA聚合

15、酶全酶(2)与模板结合-35区，酶移向10区，跨入转录起始点,2. DNA双链解开，20bp以下，通常是（171）bp,转录起始过程,3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物（ 5- 端GTP、ATP）,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3 亚基脱落，进入延长阶段,转录起始复合物:,5-pppG-OH + NTP 5-pppGpN -OH3 + ppi,（二）转录延长,1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n + NTP (NMP

16、) n+1 + PPi 3. 转录空泡 DNA/DNADNA/RNA G-CA-TA-U,转录空泡：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,DNA/DNADNA/RNA G-CA-TA-U,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,5,3,依赖Rho ()因子的转录终止 非依赖Rho因子的转录终止,（三）转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,ATP,1. 依赖 Rho因子的转录终止,2. 非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物

17、形成特殊的结构来终止转录。,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3,DNA,茎环/发夹结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,二、真核生物的转录过程,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物

18、多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件 (cis-acting element),1. 转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2. 转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(TF),参与RNA-pol转录的TF,3. 转录起始前复合物 (pre-initiation comp

19、lex, PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,4. 拼板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-po

20、l前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,-AATAAA - GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,（三）转录终止, 和转录后修饰密切相关,一、真核生物mRNA的转录后加工,（一）首、尾的修饰,5端形成 帽子结构(m7GpppGp ) 3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),真核生物的转录后修饰,5 pppGp,帽子结构的生成,帽子结构,（二）mRNA的剪接,1. hnRNA 和 snRNA,核内的初级mRNA称为 杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA) snRNA (small nuclear RNA),真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,C,A,B,D,2. 外显子(exon)和内含子(intron),外显子 在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列 内含子 隔断基因的